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标题: 【求助】超声波破碎细菌+Triton-X-100 [打印本页]

作者: chengjie79 时间: 2013-12-28 14:57 标题: 【求助】超声波破碎细菌+Triton-X-100

原核表达后超声波破碎细菌提取重组蛋白，网上很多帖子都说用含有1%的
triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，可是我在超声时加入triton后不一会就出现大量泡沫，最终导致破碎不完全，超声仪器感觉也很费劲，声音都几乎听不见了，是我哪里做得不对，但是重复了两次都是感觉加triton有问题。不解，请各位指点。

作者: chengjie79 时间: 2013-12-28 14:58

有人说是探头位置的问题，但是我感觉不是，只要不加triton泡沫就会好很多。

作者: am10 时间: 2013-12-28 14:58

triton是一种表面活性剂，或多或少会对产生泡沫有一定的贡献。
你只是做原核表达，E. coli超声破碎很容易的啊，没有必要加triton的。

作者: duoduo 时间: 2013-12-28 14:59

如果不是蛋白实在溶解不好，没必要加.

作者: am10 时间: 2013-12-28 14:59

我又想起一点，你加表面活性剂，是不是你表达的是膜蛋白？？

作者: chengjie79 时间: 2013-12-28 14:59

我表达的不是膜蛋白，但是重组蛋白可溶部分很少，大部分是包涵体，ni-nta纯化后还要复性，我就怕复性不好后面没法做活性。试试吧！
尽管我不加triton，还是有些泡沫产生，是不是蛋白变性了啊! 我用的500W，超三秒，停三秒，共破12分钟，也就是120个循环。

作者: remenb 时间: 2013-12-28 15:00

只要是有泡沫产生都意味着蛋白可能变性，建议你超3秒停6秒试一试，还有，破碎的时候盛放菌液的容器要放在冰水混合物中哦。

作者: BOSS2011 时间: 2013-12-28 15:00

我每次超声完离心后总是看见许多黑色的东西，有同学说是超的太厉害了，是不是这回事，我们那个老式超声波只能调节振幅、时间、超声间隔时间三个条件，我的条件振幅75、时间2分钟，间隔时间5s。这个时间我感觉就很短了，可每次还是有黑色沉淀。我的菌株是BL21,载体是PGEX-4YT-3,请问我怎么样才能摸索好超声条件？我用反复冻融法行不行？

作者: remenb 时间: 2013-12-28 15:01

天哪，怪不得。振幅降下来，调到30～35即可，黑色的东东是高温变性的蛋白啊。
你有没有一边冰浴一边超声啊？绝对不可以不冰浴的哦！

作者: ritou1985 时间: 2013-12-28 15:01

振幅降一些，如果你超声破碎后的包涵体要上柱纯化的话，你可以用裂解Buffer（如Buffer B）代替Trion X-100,一来裂解Buffer本身就具有破碎菌体的作用，二来它不会影响你的蛋白挂柱，我平时就是这么做的，效果还不错。还有一种配方是：溶菌酶+Trion X-100，有了溶菌酶，Trion X-100的量就可以减少些，泡沫就不会那么夸张了，效果也可以。具体的超声破碎条件就要视你的蛋白特性而定了，一般超声时间与间隔时间相当就可以了，再有你可以降低强度或超声时间，延长总的破碎时间，对你的蛋白损害小一点。再有就是战友们都提到的了：冰浴破碎，切记

作者: 阿司匹林 时间: 2013-12-28 15:03

既然你的蛋白是包涵体表达，那么建议你在超声的时候，不要加TritonX-100，出现泡沫液不是你所说的蛋白变性，包涵体蛋白是没有活性的，所以不存在变性与否的说法。在复性之前，随便怎么整都行，关键是复性条件与方法的选择。
TritonX-100是引起泡沫的主要原因，它不是消泡剂，虽然是表面活性剂.你可以选择在洗涤包涵体的时候加入Triton

作者: 阿司匹林 时间: 2013-12-28 15:04

请问我就是普通的破碎后提全蛋白不是融合蛋白
有必要超声破碎么~？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-12-28 15:05

我也是遇到了上诉问题，我的也是包涵体表达，我看到的Triton X-100怎么说工作浓度是0.1%，我现在都搞不懂是0.1%还是1%？

作者: yonger 时间: 2013-12-28 15:05

最有可能的原因是超声溶液的体积太小，而超声探头太大，插入液面的深度不够。
与Triton的关系不大。破菌不用加Triton。

作者: tuuu2 时间: 2013-12-28 15:06

就气泡的问题：
超声破碎的体积一般在10-20ml之间，你可把探头距离50ml离心管底部0.3-0.8cm，可在此范围内来调节，看超声的声音是否刺，以及是否有气泡，如果有的话一般是往下调点，在这范围内一般不会有气泡的；
还有就是在菌体重悬后，用移液器尽量把你重悬的液体表面的气泡吸走，以防在破碎过程中使的蛋白变性，以及增加破碎过程中气泡的产生；
还有就是破碎一定要在冰浴中，保持低温；
TritonX-100：
这个浓度是个范围啊，一般有些蛋白本来不溶，用去污剂处理后就溶了，这个看去污剂的浓度；但这个我不知道发文章时候，是否承认是可溶性表达；呵呵，我们一般不加去污剂，而且去污剂在蛋白纯化及活性等后续实验中是很麻烦的事，因为，透析等方法是不可能彻底去除去污剂的；
祝好运！

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