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标题: 【求助】反复做western，用丽春红染膜始终看不到条带 [打印本页]

作者: boom 时间: 2014-1-6 16:09 标题: 【求助】反复做western，用丽春红染膜始终看不到条带

本人刚学做western，多次没有结果，逐一排查原因发现，电泳后一半胶用于考马斯亮蓝染色，可以看到蛋白条带，而用另一半转膜，并在转膜时放了2张膜以防转过头，蛋白分子量是33KD，转膜的条件是：190mA恒流2个半小时（2个小时也转过），再用丽春红染膜，染膜时间为10-30分钟均试过，完全看不到条带，只能看到模糊的红色，丽春红染色液的配方是按照（10X丽春红染液丽春红S 2g；三氯乙酸 30g；磺基水杨酸 30g；蒸馏水至 100ml）来配的
不知道有高手知道这是什么原因吗，是不是用丽春红染色一定要看到条带，后面才能做出来啊
谢谢！

作者: wmp1234 时间: 2014-1-6 16:10

不知道楼主是不是两张膜都看不到条带。
我们实验室用的不是湿转，对湿转具体条件也不清楚，但是楼主用两张膜会不会有问题？据我所知都是用一张膜转的呀

作者: 8princess8 时间: 2014-1-6 16:11

先确定电转的方向没有错。一般有3个地方容易把真负极搞反，导致蛋白无法转到膜上。
1，胶和膜放的位置；2，放入电泳槽盖上盖子的时候，红黑应该对应；3，红黑导线连接到电源时，也有真负。
三个地方弄错一个，电转的方向就反了（当然，同时弄错两个的话，就负负得正了）。

作者: yychen 时间: 2014-1-6 16:12

有时候丽春红也会给咱们假相，蛋白表达低它也会检测不出来，上次我用丽春红染没有，但用考染就出来带了，个人觉得没有必要染

作者: nn255 时间: 2014-1-6 16:12

只可漂洗不要水冲容易丢失

作者: boom 时间: 2014-1-6 16:13

我也是在论坛上看到为了防止转过头可以用2张膜，正负及红黑是对应的，顺序是3层滤纸+凝胶+PVDF+3层滤纸这样的顺序来
哎昨天又搞了一次还是没有，这个折磨啊
还有个问题要请教：不知道有人碰到过没，我的抗体是买的Santa的，但是在说明书上没有样图，后面我听一个推销试剂的说，买抗体至少样图上可以看到清楚的条带这样的才好，那我买的是不是假的啊？价格是2100元

作者: boom 时间: 2014-1-6 16:13

我的目的蛋白是33KD的，我之前一直用的10%的胶，但是从marker上来看，38和26两条marker始终分的不好，我又换成12%的，我看有资料上说15-45KD的分子量建议用15%的，你们都用的多少的啊

作者: cwcwcww 时间: 2014-1-6 16:13

33KD用12%就可以了，资料上说的只是供参考，我们在实际中切身经验更可采信一些。转完膜染色看不到条带不一定就是没转上去，说实话我做过的膜可以说很少能染出带，不知是哪出了问题，继续做仍然能爆出条带，所以后来索性就不染了，主要还是一种分子量的做几回后对是否转过头心里有谱了。
-------“还有个问题要请教：不知道有人碰到过没，我的抗体是买的Santa的，但是在说明书上没有样图，后面我听一个推销试剂的说，买抗体至少样图上可以看到清楚的条带这样的才好，那我买的是不是假的啊？价格是2100元 ”
---------这个问题基本哪个抗体公司都可能出现，具体可以上各个抗体公司网站多查几个抗体可能就会发现有这种情况，没有图不是说就是做不出来，可能的情况是：抗体销售商外购的抗体，已经通过检测，但自己拿来后没有再重新检测，直接销售；还有一种情况是抗体公司本身做了检测，虽出现结果但特别难看，这也是和检测人员的实验手法都有关系等，但我们买来是可以做出结果的；另一种可能就比较不让人踏实，由于抗体数量超多，做多了不负责任的公司可能直接就拿来销售，不过这样的情况应该极少见，毕竟这关系着公司的信誉，出了问题反而自己麻烦。

作者: avi317 时间: 2014-1-6 16:14

我们用的也是湿转的。转膜的缓冲液配方是：TRIS-HCL6.05g,Gly 28.83g甲醇400ML加蒸馏水至2L。300MA，小分子转1个半小时。。然后丽春红是用4%乙酸配1%丽春红。。效果还不错，我们的25KD的条带就是这样跑的。。祝你成功

作者: is2011 时间: 2014-1-6 16:14

是不是黑胶白膜？PVDF转之前用甲醇泡过没？
WB细节很重要哦，仔细想想哪个细节出了问题吧
丽春红染色30秒就够了

作者: boom 时间: 2014-1-6 16:14

多谢大家的帮忙，昨天重新试了一次，190mA转膜3h，终于在丽春红染色后看到条带，虽然不是很清晰，但是有的，可能之前电流低了
不过又出现了一个问题，在应用190mA转膜3h后，我用考马斯亮蓝染胶后脱色竟然发现胶上还有蛋白（可是我之前用190mA转膜2h的时候，染胶的结果是胶上没有蛋白残留啊），从胶上看感觉转膜不均匀，60KD左右的蛋白转上去了而30多KD（可能是内参GAPDH）还有好多留在胶上，我的转膜液是第二次用，跟这个是不是有关系啊，在制作三明治的时候，我特地逐层挤压了气泡的，大家转膜液以及电泳液是不是全都是新鲜配制的啊
另外再提一个问题，对于7%的胶，在灌注完分离胶后，用什么封胶好呢，还是水吗？
请大家多多指教！谢谢啦

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