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标题: 【求助】用氯化钙制备DH5a感受态 [打印本页]

作者: qumm1985 时间: 2014-1-8 16:49 标题: 【求助】用氯化钙制备DH5a感受态

这一时段时间我一直在做DH5a的感受态用于转化，可就是转化不出菌来，都是按步骤来的呀，为什么呢？细菌本身的问题，还是细节中有绝技。

作者: is2011 时间: 2014-1-8 16:50

氯化钙法做出来的感受态细菌，感受效率很低，就是因为它简单省钱，所以被很多实验室奉为独尊，其实它的低感受效率往往导致转化连接产物常常失败，浪费很多时间。
用 inoue 法制备感受态吧。

作者: qumm1985 时间: 2014-1-8 16:50

转化率低，但我的是就没长出来过，不应该的吧，再说换方法的可能性不大。

作者: gmjghh 时间: 2014-1-8 16:53

氯化钙法转化效率很低，但是完全长不出来就必须分析感受态和质粒的质量了。
1、如果用空载体去转化，仍然没有长出来，但肯定就是感受态或者转化方法的问题；
2、如果用的是连接有目的片段的载体，建议用空载体再试一次，排除载体质粒的影响，因为连接效率对转化效率也有很大影响，只有一步一步排除才能找出原因。
3、另外，可能还有一个原因就是培养基中抗生素的浓度问题，确定没有用错抗生素和搞错抗生素浓度，不同的质粒抗性不一样。
祝好运！

作者: qumm1985 时间: 2014-1-8 16:54

1、用空载体做一阳性对照，好谢了。
2、另一问题：由于实验室设备简陋，没有恒温振荡培养器，所以DH5a是静止培养的，有时的手动摇摇，这样培养的细菌能用于制备感受态吗？

作者: summerxx 时间: 2014-1-8 16:54

QUOTE:

原帖由 qumm1985 于 2014-1-8 16:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、用空载体做一阳性对照，好谢了。
2、另一问题：由于实验室设备简陋，没有恒温振荡培养器，所以DH5a是静止培养的，有时的手动摇摇，这样培养的细菌能用于制备感受态吗？ ...

还是第一次见静止培养啊。制备前的细菌状态对转化效率应该是比较重要的。当然我没有试过OD值特别大的情况下来做感受态。你先用空载体转一下试试吧。
ps：附近有没有别的实验室有摇床，若有的话，拿到别人那里去摇嘛。

作者: 966735obeng 时间: 2014-1-8 16:54

哈哈哈！终于看见有一个和我基本相同遭遇的同仁了，我也是没有恒温培养箱的，也作过和你类似的事情。建议：
1、感受太的效率最好还是确定一下，也就是用空载体做个阳性对照，效率不一定不好的。我觉得一般的转化CaCl2也不错啊，很多实验室都用不仅就是因为省钱了，毕竟也是比较实用快捷的方法。
2、这个是个人想法不知道对吗，没有做更多实验区证实过。我个人感觉可能在你所谓的静态培养的条件下载体的抗性基因没有能按预计的时间表达出来，所以显示不出来的抗生素的抗性，也就没有阳性转化菌了。我曾经做过1小时内的涂板基本不长菌，可是过夜的菌液却可以得到较多的菌落。我个人感觉是正如原核表达目的蛋白一样，诱导表达时候最好到一定OD，也就是细菌有一定数量，同时也有较好生长状态的时候，如此才能得到好的诱导结果；同样，感受态复苏需要时间，静止时容易下沉，同时生长也不会那么好，是否影响了抗性表达？我不确定，你可以试一下，顺便告诉我结果。

作者: qumm1985 时间: 2014-1-8 16:55

谢谢，谢谢各位！你说的第二个问题我也想过，不过没敢过夜来恢复抗性。我会试试的。

作者: qumm1985 时间: 2014-1-8 16:55

加长复苏时间还是没成功！
我用2.5微升的质粒（滤纸上剪下的，50微升TE浸润，离心，4度保存）转化50微升感受态，（每一毫升OD600=0.42的DH5a菌液用100mmol的氯化钙制成200微升感受态）用50微克/毫升Amp筛选，可做了几次都不成功
1是否是细菌数与质粒的比例错了。
2纸上的质粒邮来后，我在常温放了一段，后又放4度，这样有问题吗？

作者: JK.jon 时间: 2014-1-8 16:55

建议你在转接后只摇2个小时，做出来的效果就很好！

作者: qumm1985 时间: 2014-1-8 16:56

QUOTE:

原帖由 JK.jon 于 2014-1-8 16:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

建议你在转接后只摇2个小时，做出来的效果就很好！

谢谢！
请问：1 挑选平板上的几个菌落在一毫升lb中培养多长时间，再转接。
2 平板上的菌在4度放几天还能用吗？

作者: mickeylin 时间: 2014-1-8 16:56

首先，CaCl2的感受态效率没有问题，做了几十个载体了，全部用这个。制备好感受态后转化0.2-0.5的空载体可以检验下转化效率。另外，菌种在4度放几个月也没问题。只是活性低一点。质粒的稳定性是很高的，把滤纸上的区域剪下来加点灭菌水，离心下即可用。

作者: kswl870 时间: 2014-1-8 16:56

可以尝试在最后一步冰浴后加上适量的培养基（不含抗性），然后培养1小时以后再铺板，可以让阳性菌落先增殖，增高阳性率。

作者: qumm1985 时间: 2014-1-8 16:57

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原帖由 kswl870 于 2014-1-8 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可以尝试在最后一步冰浴后加上适量的培养基（不含抗性），然后培养1小时以后再铺板，可以让阳性菌落先增殖，增高阳性率。

我就是热击后，冰浴2min，加800微升lb，1h铺板啊。

作者: JK.jon 时间: 2014-1-8 16:57

QUOTE:

原帖由 qumm1985 于 2014-1-8 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢！
请问：1 挑选平板上的几个菌落在一毫升lb中培养多长时间，再转接。
2 平板上的菌在4度放几天还能用吗？

你挑单菌落到3ml LB(尽量别用1 ml L后，37℃下，摇床上培养12-16小时.再以1%的比例转接到新的培养基（按你做的量斟酌，如10，100，200ml等体积）中，37℃下，在摇床上培养2小时。这里“1%的比例”，就是指你转接后体系体积的1%。如，你要转接到100ml LB中，那么就接入1ml的菌液。
平板上的菌在4度放几天肯定还能用，但前提是你得保证初始划线及培养没有污染！
祝你好运！

作者: qumm1985 时间: 2014-1-8 16:58

前天我又做了一次，
没加质粒的，50ug/mlAMP平板上长了一个菌落（A菌落）；
两个加质粒的，一个长了十几个（B菌落），一个二十几个。
我把B菌落在AMP培养液培养了一夜（C），A菌落在无AMP中速混匀1h（D），C和D各100uml铺平板（100ug/mlAMP），隔夜都长出一层菌。
这是为什么？原菌突变有抗性了？

作者: 8s5g 时间: 2014-1-8 16:58

前天我又做了一次，
没加质粒的，50ug/mlAMP平板上长了一个菌落（A菌落）；

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污染

作者: 8s5g 时间: 2014-1-8 16:59

两个加质粒的，一个长了十几个（B菌落），一个二十几个。

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不知道铺板用了多少ul菌液，如果200ul的话，那就表明感受效率低了。

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