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标题: 【求助】植物叶片全蛋白2D电泳求教 [打印本页]

作者: toy 时间: 2014-1-9 10:55 标题: 【求助】植物叶片全蛋白2D电泳求教

我做2D已经有段日子了，可是感觉还是有很多问题，恳请各位高手指点交流。
我的材料是植物叶片，用的是TCA-丙酮沉淀提取，然后用裂解液溶解后离心上样。这里边的离心一般应该采用多少G？我使用的是15000rpm可以吗？之后我用的是pH 4-7 ，13cm 胶条。
IEF程序： 30 V 12Hr， 100 V 1Hr，200 V 1Hr， 500 V 1Hr， 1000 V 1Hr ，8000V grad 1Hr，8000V 聚焦64000Vhr。之前做的总有明显的横向拖尾，因此我增加了聚焦。
接下来，胶条平衡，SDS-PAGE ，采用银染。
附图如下：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=22677

作者: toy 时间: 2014-1-9 10:56

上端是前沿，左边为正极。
顶部的那条横纹很明显，做了几次总是有，不知道怎么样才能解决。
底部大分子区域，横向拖尾也很严重，我增加聚焦后，有一定的改善，但是还是不理想。
我之前用pH 3-10 的做过，感觉高pH 端蛋白点很少，所以才更换用4-7 。然而，做下来感觉点很少，貌似没有完全分开，是要进一步增加聚焦么？稍后我发以前的pH 3-10的图。
大家帮我看看，指点下阿！先谢过了~

作者: toy 时间: 2014-1-9 10:56

之前pH 3-10 的图，也做的不好，大家多指教指教...

图片附件: 29282277.jpg (2014-1-9 10:56, 16.08 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=22678

作者: DONT 时间: 2014-1-9 10:56

我以前也做过植物各个部位的蛋白提取，感觉叶片里的蛋白还是很多的，但是植物细胞里面的色素比较多，所以提取出的蛋白样品一般颜色较深。我推荐一个protocol，祝你成功
1、液氮研磨样本，充分破碎组织。叶片是很好磨的部分，一定要研成粉。
2、预冷的 TCA/丙酮/65mM DTT 沉淀，-20度，一小时，离心，去上清，风干。预冷丙酮沉淀，-20度，1小时。离心，去上清，风干。
3、裂解。1.5ml EP管中放入100-200ul样品，加入1ml裂解液，超声破碎
4、离心，收上清。这里样品中有很多颗粒，所以转速一定要高
5、0.22um滤膜过滤，如果你上一步做的好，这一步是很轻松就能过的
6、超滤浓缩样品（建议用超滤管超滤），备用

作者: shenkunjie 时间: 2014-1-9 10:57

上了多大量啊！感觉点不是很多，如果浓度还可以的话，稍微纯化一哈，尝试一哈！纯化后加大上样量，用4-7的胶条跑一个看看！
选个试剂盒纯化就挺好用的！

作者: toy 时间: 2014-1-9 10:57

叶片的蛋白提取，色素确实很多，我得到的蛋白沉淀也都带有淡淡的颜色，有裂解液裂解后，15mg/300ul 裂解液。我的提取蛋白程序和你的差不多，我TCA-丙酮溶液加入的是巯基乙醇。之后用丙酮洗涤沉淀2次，15000rpm 离心后，风干。
裂解的时候我没有用超声，因为我实验室没有适合的超声仪。我就是混匀后放置在4 度3Hr。
我每步离心都是15000rpm，是要再提高吗？
我也看到很多的地方说要超滤浓缩，但是我不晓得具体怎么操作..（比较菜），能给我具体说说吗？

作者: toy 时间: 2014-1-9 10:58

我4-7的那个胶上样量250ug。
现在我也觉得样品的制备可能存在很多问题..
像很多帖子里说的要除盐，除脂除核酸的..我就像上面说的，没有再进一步纯化过。
请教下，都有哪些好的纯化的方法么...买试剂盒..clean up kit 考虑过，但是太贵了，买不起啊...

作者: toy 时间: 2014-1-9 10:58

我正计划着重新制备一次蛋白样品：
叶片液氮研磨后加入预冷的10%TCA、0.07%巯基乙醇的丙酮溶液中，4度放置1Hr，20000g离心30min，沉淀用含0.07%巯基乙醇的丙酮重悬，4度过夜。20000g离心30min后，用90%丙酮洗涤沉淀2次，风干。再用裂解液溶解，放置3Hr，20000g离心30min，取上清液上样。
大家分析一下，这样行不？还需要什么别的处理过程？我看到很多帖子说超滤浓缩，我做的是植物叶全蛋白，超滤管应该如何选取呢？裂解时，蛋白确实很难溶解，有什么好的方法没？请多多指教~谢了

作者: one 时间: 2014-1-9 10:58

叶片液氮研磨后加入预冷的10%TCA、0.07%巯基乙醇的丙酮溶液中，4度放置1Hr，
这一步过夜是不是更好一些呢？？？
tca--丙酮是起沉淀作用的，丙酮只是洗的吧？？？

作者: toy 时间: 2014-1-9 10:59

我又重新提了一次蛋白，并且继续增加了聚焦时间做了一次。不知道什么原因，第一项IEF电压没有上升到8000V，第二项跑完染色后，图特别的糟糕，在高分子量区域黑成一片。难道是我蛋白提取又出现问题了？离子浓度太大？真是郁闷至极...图就不发了..
休整一下，明天继续...

作者: huifeng0516 时间: 2014-1-9 10:59

我觉得点少，可以再提高浓度，dtt量适当减少

作者: IAM007 时间: 2014-1-9 10:59

我一般10%TCA、0.07%巯基乙醇的丙酮溶液中，4度放置过夜，之后个隔1小时离心，并且看你的图谱好像银染染色有点过，我也是做植物的，也没用过超声波，如果电压没升到8000v,可以考虑用丙酮多洗沉淀一次

作者: fei1226com 时间: 2014-1-9 11:00

两个问题：1 楼主定量方法可能有问题，最明显的表观就是蛋白量少。
2.A-A 方法是有缺陷的，TCA 成酸性，注定了该方法比较适合偏碱性的蛋白（跟据蛋白提取的一些基本原理），楼上有说沉淀过夜，我并不赞同，长时间浸泡在酸性环境中，可能导致大量酸性蛋白的复溶困难，甚至最终复溶丢失。
对于TCA-A 方法推荐不要放置时间过长，最好在4小时内，且放置在-20°条件下，期间每隔15-30 分钟，漩涡震荡一次，每次至少20秒。其后的操作流程和5楼相同，不过丙酮洗涤次数可以增加1-2次。
在者楼主使用的是4-7 的胶条，其为酸性蛋白，点少也正常。
最终上样前离心推荐40000G 一小时，效果明显会改善。

作者: mysmdbl 时间: 2014-1-9 11:00

楼主，你的电压上不去——
你可以试试，丙酮多洗1次，我一般洗3次。
两性电解质量一定要少，不要超过1%。
溴酚蓝不要在一向加。
反正我一直电压在10000v，电流32uA/gel，上的去。

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