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标题: 【求助】GST融合蛋白诱导 [打印本页]

作者: jrwyyplt 时间: 2014-1-9 11:01 标题: 【求助】GST融合蛋白诱导

大家好。最近我做GST融合蛋白，做了几次表达不出来。
我的目的蛋白36K。连接的重组体已经测序，测序结果没有问题，也已经融合上。可是，30度，用IPTG1mM诱导4小时，从SDS-PAGE结果看，只发现对照组有GST蛋白表达，重组质粒没有表达出目的融合蛋白。
希望各位高手指点下！！

作者: u234 时间: 2014-1-9 11:01

不表达原因挺复杂的，我们实验室貌似经常会遇到这种事。
检查一下质粒启动子、ATG等有没有问题，要不换个载体，换个菌株。祝好运！

作者: jrwyyplt 时间: 2014-1-9 11:02

可是空载体转化的有GST表达呀
所以我觉得启动子没问题吧

作者: u234 时间: 2014-1-9 11:03

空载序列没问题，难道敢保证重组质粒序列就没问题？
因为没表达，无非就是要确保重组质粒、表达菌株、诱导条件。空载都能表达，意味着诱导条件，菌株是没问题的啊！
PS：多想想，多排除，我们实验室出现不表达的情况，我们实验员把质粒序列都检查过了，没问题，就是不表达，有时是无法解释的，但同学换个载体就行了。

作者: jrwyyplt 时间: 2014-1-9 11:03

我看看吧。现在我用的是PGEX-4T-2，菌株是BL21。现在我同学用相同的质粒和菌株表达出了GST融合蛋白，而且量相当大。你能否推荐几个合适的载体呀？？有些啰唆，见谅见谅呀，试验在此停滞不前，急呀

作者: guagua 时间: 2014-1-9 11:04

其他的表达系统最常见的就是 pQE 系列和 pET 系列。
实验室有的话就试试看，没有的话找别人要一点，或者换蛋白质。
Are you sure the plasmid DNA sequence is OK?

作者: jrwyyplt 时间: 2014-1-9 11:04

测序结果是正确的没有问题呀

作者: H2O 时间: 2014-1-9 11:05

连WB都测不到啊？你有没有看你的序列里是不是有很多稀有密码子啊？特别是ATG后面25个氨基酸。

作者: guagua 时间: 2014-1-9 11:05

不妨换一下表达菌种，推荐用Rosetta (DE3)试试，它可以有效表达一些稀有密码子！我今年刚毕业的一个师姐就遇到这样的问题，她也是做GST融合表达的，先前在BL21怎么都表达不出来，换成Rosetta 就表达了！

作者: jrwyyplt 时间: 2014-1-9 11:06

谢谢了呀我试验试验下
那个稀有密码子多少是多呀

作者: plaa 时间: 2014-1-9 11:06

大家好。最近我做GST融合蛋白，做了几次表达不出来。
我的目的蛋白36K。连接的重组体已经测序，测序结果没有问题，也已经融合上。可是，30度，用IPTG1mM诱导4小时，从SDS-PAGE结果看，只发现对照组有GST蛋白表达，重组质粒没有表达出目的融合蛋白。
希望各位高手指点下！！

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仅仅从SDS-PAGE就能判断你的融合蛋白没有表达？这个结论也下得太容易了，要知道，不是所有蛋白都能表达出一坨坨的。。。对照组仅仅是GST，所以表达量相对较高而已。为何不尝试亲和纯化后再跑电泳或者Western blot检测？
ps. 可以对融合基因进行测序，但是载体就不必测序了，劳民伤财，没有一点意义。

作者: mimili_901 时间: 2014-1-9 11:06

请检查一下ORF！

作者: zhezhe 时间: 2014-1-9 11:07

Rosetta (DE3)菌株不错可以试一下，不行的话，做一下密码子优化吧！

作者: 04906 时间: 2014-1-9 11:07

为什么选择30度呢？

作者: guagua 时间: 2014-1-9 11:08

目的基因mRNA的二级结构怎样、有没有稀有密码子、目的蛋白有没有毒性这都是值得考虑到问题。据说Rosetta (DE3)针对后者还不错，但表达量不会太高，PGEX-4T-2我一个师兄用DH5a也能表达。总之，多试试吧，我们对蛋白表达还知之甚少，运气也有很大成分。祝好运！

作者: guagua 时间: 2014-1-9 11:08

大家好。最近我做GST融合蛋白，做了几次表达不出来。
我的目的蛋白36K。连接的重组体已经测序，测序结果没有问题，也已经融合上。可是，30度，用IPTG1mM诱导4小时，从SDS-PAGE结果看，只发现对照组有GST蛋白表达，重组质粒没有表达出目的融合蛋白。
希望各位高手指点下！！

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我觉得可以更换下诱导温度，不同蛋白的最佳诱导温度是不一样的。

作者: guagua 时间: 2014-1-9 11:09

另外，你跑胶用的样是上清中的蛋白吗，有时候蛋白在包涵体中，不妨用点沉淀中的样试试~~

作者: jrwyyplt 时间: 2014-1-9 11:09

QUOTE:

原帖由 guagua 于 2014-1-9 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

另外，你跑胶用的样是上清中的蛋白吗，有时候蛋白在包涵体中，不妨用点沉淀中的样试试~~

我是用SDS上样缓冲液变性后，跑的电泳啊
包涵体也会裂解的

作者: yueban-1147 时间: 2014-1-9 11:23

不知道你是否预测了信号肽，如果你目的序列带有信号肽可能会导致无法表达，可以到预测信号肽的网站预测一下！cuturl('http://ptai.bioon.cn/user2/11798/archives/2006/74074.shtml')

作者: jrwyyplt 时间: 2014-1-9 11:23

QUOTE:

原帖由 yueban-1147 于 2014-1-9 11:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不知道你是否预测了信号肽，如果你目的序列带有信号肽可能会导致无法表达，可以到预测信号肽的网站预测一下！cuturl('http://ptai.bioon.cn/user2/11798/archives/2006/74074.shtml') ...

>Sequence
Prediction: Signal peptide
Signal peptide probability: 0.771
Signal anchor probability: 0.125
Max cleavage site probability: 0.241 between pos. 22 and 23
是不是挺高啊？

作者: jujuba 时间: 2014-1-9 11:24

楼主十之八九表达的是一个膜蛋白

作者: zsxan1990 时间: 2014-1-9 11:24

不表达原因挺复杂的，我们实验室貌似经常会遇到这种事。
检查一下质粒启动子、ATG等有没有问题，要不换个载体，换个菌株。祝好运！

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支持！载体构建时有没有注意移码的问题，表达时的稀有密码子问题

作者: abc816 时间: 2014-1-9 11:24

不表达的原因实在有太多种了
可能很多人会忽视酶切位点的影响。
就拿pGEX-4T-2来说，如果用了ECOR I SAL I XHO I这3个酶切位点作为5`的位点，如果不删补碱基，那表达的时候序列就会移码突变，导致无法表达，或者错误表达。

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