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标题: 【求助】膜蛋白提取 [打印本页]

作者: minran_1980 时间: 2014-1-19 13:02 标题: 【求助】膜蛋白提取

请教大家曾使用过的比较成熟的细胞膜蛋白提取方法及其中的液体配方，谢谢！

作者: feima+ 时间: 2014-1-19 13:02

用RIPA强配方，把脱氧胆酸钠浓度调整至1.0%，同时加入NP-40和Triton X-100，浓度均为1%。我刚做了一个7次跨膜蛋白，LHR的WB。

作者: ququer787 时间: 2014-1-19 13:03

前些天用凯基的膜蛋白提取试剂盒提了小鼠的大鼠的和心肌细胞系的膜蛋白可是WB结果很不好目的蛋白没有只有在细胞系的全细胞蛋白中有条分子量不对的带，请教一下除了上述RIPA强配方之外，您其他的操作是怎样的，是不是和普通的提全细胞蛋白一样，最后需要离心吗？

作者: 49888 时间: 2014-1-19 13:03

用RIPA强配方，把脱氧胆酸钠浓度调整至1.0%，同时加入NP-40和Triton X-100，浓度均为1%。我刚做了一个7次跨膜蛋白，LHR的WB。

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请问这位高手，可以把你的实验步骤、条件列出给大家看看吗？谢谢！

作者: vvmmoy 时间: 2014-1-19 13:04

1. Wash adherent cells twice in the dish or flask with ice-cold PBS and drain off PBS.
2. Add ice-cold modified RIPA buffer to cells (1 ml per 107 cells/100 mm dish; 0.5 ml per 5 x 106 cells/60 mm dish).
3. Scrape adherent cells off the dish or flask with either a rubber policeman or a plastic cell scraper that has been cooled in ice-cold distilled water. Transfer the cell suspension into pre-chilled Eppendorf microcentrifuge tubes. put it on ice for 20 minutes to lyse cells.
4. After vortex-mixing, centrifuging at 12,000 rpm for 10 min. at 4 ° C. Remove the supernatant and quantitate using a BCA Protein assay .

作者: 49888 时间: 2014-1-19 13:04

QUOTE:

原帖由 vvmmoy 于 2014-1-19 13:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1. Wash adherent cells twice in the dish or flask with ice-cold PBS and drain off PBS.
2. Add ice-cold modified RIPA buffer to cells (1 ml per 107 cells/100 mm dish; 0.5 ml per 5 x 106 cells/60 mm dis ...

要提取组织膜蛋白呢？应该怎样？组织与裂解液的比列如何？

作者: birdfish 时间: 2014-1-19 13:05

以下是裂解液配方和方法
裂解液配方: 通常组织裂解液有三种,
1. 全细胞蛋白的分离提取液(mmol/L )：Tris-HCl 50, pH 7.5, NaCl 150, EDTA 5, EGTA 5, SDS 2%。
2. 胞浆蛋白提取液(mmol/L): Tris-Cl 50，pH 7.5, EGTA 2, EDTA 2, (DTT 2, Na Pyrophosphate 5, KF 50, Okadaic acid 50M，5mg/L each of leupeptin, aprotintin, pepstatin A, chymostatin)。(括号内为磷酸酶抑制剂,如果不做磷酸化可不加如)
3. 膜相关蛋白提取液(mmol/L):胞浆蛋白提取液+ 0.5% NP-40。
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胞溶和膜相关蛋白的分离提取:
*冻存或新鲜的组织或细胞，按每mg组织10μl的比例加入胞浆蛋白提取液。
*手持式匀浆器匀浆、超声破碎。
*4℃ 30000g离心30min，取上清液作为胞溶蛋白成分(Cytosolic)保存。
*沉淀物再加入相同体积的膜相关蛋白提取液(胞浆蛋白提取液＋0.5％NP-40)。
*超声破碎，在4℃ 30000g继续离心30min，取上清液作为膜(包括细胞膜和各种细胞器膜)相关蛋白成分(Particulate)。
*BCA法蛋白定量。

作者: 2541 时间: 2014-1-19 13:05

我们通常说的总蛋白提取，是否包括胞膜，胞浆，和核蛋白？

作者: bluelake 时间: 2014-1-19 13:06

是的，一般总蛋白提取液的强度都比较高，可以得到全蛋白

作者: 18270881747 时间: 2017-8-16 18:45 标题: 回复 #2 feima+ 的帖子

可以用Triton114代替100吗

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