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标题: 【求助】抗体电泳，遭遇奇怪情况 [打印本页]

作者: purrr 时间: 2014-1-24 23:52 标题: 【求助】抗体电泳，遭遇奇怪情况

老同志遇到新问题
原液样品为：杂交瘤上清，单抗
纯化方式为：protein A纯化,纯度在90-95%之间（现有抗体纯化平台做过上千个单抗多抗的纯化）
流穿为：样品流经proteinA柱子后
问题组和正常组，2个不同的项目，但是同一次实验的结果，所以实验条件可以认为相同，电泳为SDS-PAGE变性电泳
问题组的抗体重链，疑似形成大分子聚合物，在分离胶顶部
何故？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=22843

作者: purrr 时间: 2014-1-24 23:52

老同志遇到的第2个新问题
重组抗体IgG，变性电泳
左边为正常组，右边为问题组，实验条件一样，同块胶跑的电泳
原液为：重组上清
CT为：重组上清过proteinA柱流穿
ab为：抗体
问题组出现一100KD明显杂带，经非还原电泳检测，无IgG外杂蛋白，估计此100KD杂带为IgG来源，或许是重链聚体，或许为重轻链结合物
有没有兄弟姐妹遇到过这样的问题？为什么会产生这样的情况？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=22844

作者: october7 时间: 2014-1-24 23:52

第一张图不知道正常和异常组的洗脱峰有没有什么区别？

作者: purrr 时间: 2014-1-24 23:53

QUOTE:

原帖由 october7 于 2014-1-24 23:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一张图不知道正常和异常组的洗脱峰有没有什么区别？

GE公司的proteinA亲和填料，洗脱峰都是一样的，单峰，如果去跑HPLC-SEC估计有天然的2聚体存在，但是这个2聚体我们测试过一般5%左右；而第1张图上，重链几乎都是聚成大分子在分离胶的顶部，而且只是重链出问题，轻链很正常，所以不象是天然2聚体的原因

作者: BUK 时间: 2014-1-24 23:53

从原液上看不是柱子提纯的问题，更像是抗体的问题，你测抗体的类型了吗

作者: purrr 时间: 2014-1-24 23:54

QUOTE:

原帖由 BUK 于 2014-1-24 23:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

从原液上看不是柱子提纯的问题，更像是抗体的问题，你测抗体的类型了吗

我也觉得是抗体的问题
请问什么抗体类型会出现这样的重链聚合情况？

作者: purrr 时间: 2014-1-24 23:54

第1图中
什么原因会导致重链的聚集，而且聚集出来的分子，在常规还原变性电泳中，远大于250KD（从上往下第一条mark），进了分离胶，但是没跑多远……

作者: purrr 时间: 2014-1-24 23:55

自己顶！
现在感觉聚体的可能性居大，因为就算是单体的IgG没有被还原彻底，条带位置也没有那么高，刚进分离胶就走的没多远
聚体有2种可能
1，天然表达的时候，重链就是以聚体的形式表达，而且这个聚体还不易被常规的2-ME打开
2，天然是正常的IgG单体，但是在加电泳loading buffer后，经煮沸5分钟后，重链形成了聚体
，这种情况下，问题的关键就是象2-ME这样的还原剂能把单独的重链还原成多聚体？常理应该是解开重链。

作者: yes4 时间: 2014-1-24 23:56

第一组的轻链也偏小，你的protein A是新的么？

作者: purrr 时间: 2014-1-24 23:56

QUOTE:

原帖由 yes4 于 2014-1-24 23:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

第一组的轻链也偏小，你的protein A是新的么？

轻链位置差不多，基本在25kd附近
proteinA柱子，我们用过以后都用盐酸胍和NaOH 作CIP在位清洗，基本排除杂蛋白的影响

作者: bgf5 时间: 2014-1-24 23:57

自己顶！
现在感觉聚体的可能性居大，因为就算是单体的IgG没有被还原彻底，条带位置也没有那么高，刚进分离胶就走的没多远
聚体有2种可能
1，天然表达的时候，重链就是以聚体的形式表达，而且这个聚体还不易被常规的2-ME打开
2，天然是正常的IgG单体，但是在加电泳loading buffer后，经煮沸5分钟后，重链形成了聚体
，这种情况下，问题的关键就是象2-ME这样的还原剂能把单独的重链还原成多聚体？常理应该是解开重链。

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这样的问题遇到过很多次，你的思路应该没有问题。电泳纯度只能作参考，辅以HP-SEC可以帮助我们作判断。
你说的可能性中，我也认为第二种是可能的解释。事实上，不仅SDS-PAGE的样品处理会产生聚集，还会产生片断，这一点是肯定的。
可以做一个Western, 排除是其他的杂带，比如用anti-H chain antibody和anti-L chain antibody去检测一下，就知道了。如果没有没完全打开成线装，那么分子量是很难用marker估计的。
另外，2-ME的还原能力是不够的，还是建议新鲜配置loading buffer (含DTT)比较好。我曾做过不同的DTT的浓度对Ab电泳结果的比较，确实会有很大差异，另外煮的时间也是有影响的。
关于HP-SEC的问题，可以进柱前测定总蛋白，然后看看出峰面积是否合理（峰面积可以定量）？如果大的聚集体进柱后沉淀在柱子上，是不会出峰的，这样得到的monomer的含量会偏高，聚体含量会偏小，所以<5% aggregate也就不可信了。

作者: purrr 时间: 2014-1-24 23:57

QUOTE:

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自己顶！
现在感觉聚体的可能性居大，因为就算是单体的IgG没有被还原彻底，条带位置也没有那么高，刚进分离胶就走的没多远
聚体有2种可能
1，天然表达的时候，重链就是以聚体的形式表达，而且这个聚体还不易被常规的2-ME打开
2，天然 ...

谢谢你的参与
我们也发现不同的2-ME浓度和不同的煮沸时间对于某些样品都能导致不同的结果，这个跟样品本身的特性有关，有些容易还原的IgG，不管你用什么还原条件，基本都能还原开重链轻链。
前面图1，我们还没做WB，但从大分子带，原液中有，流穿里无，而proteinA纯化产物里又出现，这样可以判定为重链的聚体，我比较奇怪的是，什么因素导致它在2-ME存在的情况能聚合成那么大的带？？
图2中100KD的带，我们做了抗重链和抗轻链的结果。都能显色，抗轻链的还没做，不过这个100KD带，有可能是还原不彻底
等下个礼拜有时间取订个DTT来试一下

作者: bgf5 时间: 2014-1-24 23:58

不同的抗体确实不一样，呵呵
另外，Protein G和很多种抗体的Fab段也有亲和力，呵呵
所以可能还有其他可能，时间允许的话也可以验证一下。

作者: purrr 时间: 2014-1-24 23:58

QUOTE:

原帖由 bgf5 于 2014-1-24 23:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不同的抗体确实不一样，呵呵
另外，Protein G和很多种抗体的Fab段也有亲和力，呵呵
所以可能还有其他可能，时间允许的话也可以验证一下。

proteinG 确实存在一定程度和FAB结合的情况
我们用的是rProteinA
继续等待遇到过同样问题的人

作者: xevin 时间: 2014-1-24 23:59

相关疾病：
多发性骨髓瘤

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老同志遇到新问题
原液样品为：杂交瘤上清，单抗
纯化方式为：protein A纯化,纯度在90-95%之间（现有抗体纯化平台做过上千个单抗多抗的纯化）
流穿为：样品流经proteinA柱子后
问题组和正常组，2个不同的项目，但是同一次实验的结果，所以实验条件可以认为相同，电泳为SDS-PAGE变性电泳
问题组的抗体重链，疑似形成大分子聚合物，在分离胶顶部
何故？

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从胶上看这个抗体的结构是不太一样：
1、样品中抗体的含量是高于你所说的正常抗体的，但是结合在Protein A上的量不是相应的多，
2、纯化后的轻链还是比正常的略小
猜测一下：
1、是否是IgM给挂上了？
2、另外，检测一下细胞株的染色体数，是否是不同的骨髓瘤细胞融合的？我认为这个的可能性很大。
因为结构不同，采用同样的变性条件处理样品，SDS-PAGE结果不同就好理解了。

作者: purrr 时间: 2014-1-25 00:00

QUOTE:

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相关疾病：
多发性骨髓瘤

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老同志遇到新问题
原液样品为：杂交瘤上清，单抗
纯化方式为：protein A纯化,纯度在90-95%之间（现有抗体纯化平台做过上千个单抗多抗的纯化）
流穿为：样品流经proteinA柱子后
问 ...

谢谢热心参加讨论
1，IgM 不能被变性还原打开？
2，按道理IgG不会被proteinA给结合纯化下来
3，骨髓瘤细胞应该是同一侏，脾细胞是不同抗原的

作者: xevin 时间: 2014-1-25 00:00

QUOTE:

原帖由 purrr 于 2014-1-25 00:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢热心参加讨论
1，IgM 不能被变性还原打开？
2，按道理IgG不会被proteinA给结合纯化下来
3，骨髓瘤细胞应该是同一侏，脾细胞是不同抗原的

1、不是说IgM不能被变性打开，而是指与IgG同样的电泳处理条件下效果会有不同。我记得SDS-PAGE的样品处理时是有具体的比例的，只不过我们用一个常用的配方和比例来代替了。前面看你准备试试新的DTT，建议浓度也可以变化一下。
2、按道理IgM是很少被ProteinA结合的，但是这里是杂交瘤产生的抗体，与天然的还是有些不同，这也是为什么我想知道是否同一株骨髓瘤细胞的原因。
3、实际上这个问题有点广，可以牵涉到细胞要求建库等方面，要尽可能保证这些细胞的稳定性和可重复性。
还有个问题可以与你讨论一下，你做过很多种单抗的纯化，有无发现除了轻链、重链外的条带很难除去掉？

作者: purrr 时间: 2014-1-25 00:00

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原帖由 xevin 于 2014-1-25 00:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、不是说IgM不能被变性打开，而是指与IgG同样的电泳处理条件下效果会有不同。我记得SDS-PAGE的样品处理时是有具体的比例的，只不过我们用一个常用的配方和比例来代替了。前面看你准备试试新的DTT，建议浓度也可以变化一 ...

相关疾病：
腹水

单抗的来源大概有4种。
1，腹水
2，杂交瘤体外培养上清
3，真核重组表达（293/CHO/NS0）
4，噬菌体重组表达
对于抗体纯化（除小鼠IgG以外）一般来说用比较好的牌子的rProteinA填料，辅以一定的纯化优化，比如注意ph,binding buffer 盐离子浓度等，一般一步就可以达到很好的纯度（90-95%），不会有其他明显的杂带。我们曾经有个样品经过第三方一个制药公司提供的检测报告，在纯度方面是和人家2步法（proteinA+离子交换）一致。
您所说的重链轻链外的条带是通过电泳发现的杂带还是其他纯化手段分离到的杂蛋白？
假如是电泳分离发现有杂带，有可能象我遇到的问题那样。
如果排除掉上面的原因，那最有可能就是某种蛋白在原液里浓度非常高，纯化的过程中因为各种各样的原因夹杂在洗脱组分里，比如有些原液培养基中，牛血清白蛋白的含量非常之高

作者: xevin 时间: 2014-1-25 00:01

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原帖由 purrr 于 2014-1-25 00:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

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单抗的来源大概有4种。
1，腹水
2，杂交瘤体外培养上清
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对于抗体纯化（除小鼠IgG以外）一般来说用比较好的牌子的rProteinA填料，辅以一定的纯化优化，比如注意ph,bin ...

我理解你所说的4种单抗来源是建立在细胞株基础上的，不知对否？我所说的来源是指细胞建株过程。其它的条带是通过细胞融合过程制备细胞株的方法，与基因工程（含转基因动物）制备单克隆抗体的过程不同。这种建株方式的不同会导致产生抗体的理化性质不同。
这些扯得远了，希望能有所帮助。

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