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标题: 【求助】融合蛋白酶切、鉴定问题 [打印本页]
作者: memory    时间: 2014-2-7 17:48     标题: 【求助】融合蛋白酶切、鉴定问题

我表达了一个麦芽糖融合蛋白，麦芽糖大约42KD，我的目的蛋白10KD左右，送质谱测序都测不到我的目的蛋白（我觉得可能是目的蛋白太小的原因吧），明年初就要答辩了，时间比较急，不知道我要如何鉴定我的目的蛋白呢？有什么比较快的方法？请大家帮帮忙
作者: wood533    时间: 2014-2-7 17:49


不是大小的事，应该是浓度不够，你问问测序的老师，我记得浓度要达到一定程度才可以，你可以先浓缩一下再送样！
作者: wmp1234    时间: 2014-2-7 17:50


不是大小的事，应该是浓度不够，你问问测序的老师，我记得浓度要达到一定程度才可以，你可以先浓缩一下再送样！
作者: duoduo    时间: 2014-2-7 17:55


我也遇到同样的问题，也是麦芽糖融合蛋白做载体，但测序的时候M13那一段测不出来，我的目的基因是1kb，在上海生工测的，只测出了mbp那一段的序列，还在找原因中，虽然帮不上什么忙，但可以交流一下！
作者: memory    时间: 2014-2-7 20:16


浓度不够可以测出麦芽糖吗？请教下楼上，谢谢！
作者: memory    时间: 2014-2-7 20:16

我也遇到同样的问题，也是麦芽糖融合蛋白做载体，但测序的时候M13那一段测不出来，我的目的基因是1kb，在上海生工测的，只测出了mbp那一段的序列，还在找原因中，虽然帮不上什么忙，但可以交流一下！
你的蛋白应该比我的大啊，为什么也只测到MBP呢？现在原因出来了吗？还有什么方法可以鉴定吗？希望交流。
作者: leifengta    时间: 2014-2-7 20:17


1、进行DNA测序,保证构建正确；
2、融合蛋白作WB鉴定；
3、用蛋白酶切掉麦芽糖融合蛋白，再质谱测序。
作者: memory    时间: 2014-2-7 20:17


WB做不了，目前没有这个抗体卖，我用麦芽糖蛋白酶切，没有成功，不知道楼上的做过没？指教下。还有一个问题就是，如果切出来之后，10KD的蛋白考马斯亮兰染色能染出来吗？听说好像不行哦
作者: leifengta    时间: 2014-2-7 20:18


我正好用pMAL原核表达系统做过麦芽糖结合蛋白与目的蛋白的融合表达与纯化。
1、有针对麦芽糖结合蛋白(MBP)的抗体做WB, anti-MBP mAb 或anti-MBP antiserum，见NEB的目录；
2、有Factor Xa 或Enterokinase等蛋白酶可以切割，如果酶切不成功，也可以从一个方面说明你表达的蛋白有问题；不过蛋白酶切条件要摸索，要做一个酶切梯度
3、另外10KD的蛋白考马斯亮兰染色是能染出来的
作者: memory    时间: 2014-2-7 20:18


1.用麦芽糖结合蛋白的抗体做WB有什么意义？
2.我现在正在酶切，还没有成功，你所说的酶切梯度怎么设计？可以具体点吗？
3.你确定10KD能染出来吗？以前有师兄做10KD的，测序对了，但跑胶染不出哦
谢谢
作者: leifengta    时间: 2014-2-7 20:19



QUOTE:
原帖由 memory 于 2014-2-7 20:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1.用麦芽糖结合蛋白的抗体做WB有什么意义？
2.我现在正在酶切，还没有成功，你所说的酶切梯度怎么设计？可以具体点吗？
3.你确定10KD能染出来吗？以前有师兄做10KD的，测序对了，但跑胶染不出哦
谢谢 ...

1、首先你做构建质粒时要DNA测序，证明目的蛋白已经与麦芽糖结合蛋白正确连接了；因为你的目的蛋白没有抗体，所以就可以用与它融合的标签即麦芽糖结合蛋白的抗体做WB，其意义就在于用麦芽糖结合蛋白的抗体做WB如果有阳性，也就可以证明你的融合蛋白已经正确表达了，也就是你的目的蛋白也表达了；
2、蛋白酶切梯度就是所加融合蛋白与蛋白酶的不同量的酶切试验，即酶切体系中它们量的不同比例；其实，另外，你最好还要做酶切时间梯度、温度梯度，即设置不同的酶切时间（比如酶切6、12、24小时等等）、不同温度下酶切（如4、37度或室温等等）
3、我们用一般的SDS-PAGE胶，6.5kDa的蛋白标准条带都很清楚啊；师兄做10KD的，测序对了，但跑胶染不出只能证明他的制胶、电泳或染色等有问题？如果更小的条带，你可以配制针对小分子的PAGE胶。
作者: memory    时间: 2014-2-7 20:19

我之前测过DNA了，是正确的，而且过了亲和层析柱，跑SDS-PAGE电泳也出现了大小一致的条带，应该还是有东西的，至少麦芽糖应该有，送质谱测，也只测出麦芽糖，不知道是不是因为质谱覆盖率的问题，还是我真的只表达出了麦芽糖？我现在时间不充足，所以想做蛋白酶切之后再送测。楼上的有什么建议
作者: memory    时间: 2014-2-7 20:20

酶切的体系我是按蛋白和factor Xa质量 50：1的比例切的，25度4小时，4度过夜
作者: kuaizige    时间: 2014-2-7 20:21

我先在换公司给我测，结果还没有出来
作者: kuaizige    时间: 2014-2-7 20:21


我现在还没有做到纯化，你测序时有没有测到Factor Xa 酶切的那几个蛋白的基因序列正确性？
还有就是你SDS电泳是麦芽糖空载体的对照诱导有没有做？可以大概估计一些位置的正确性啊。
作者: memory    时间: 2014-2-7 20:23


空载体诱导出的是不是单纯麦芽糖蛋白啊？我的相差10KD好像位置相差不是很大啊，有点难度
作者: memory    时间: 2014-2-7 20:32


你测序时有没有测到Factor Xa 酶切的那几个蛋白的基因序列正确性？
这个我没有注意到哦，有什么意义？
作者: zhezhe    时间: 2014-2-7 20:33


空载体诱导后的蛋白应该是42KD的蛋白，如果用15%-18%的分离胶跑电泳应该是可以看出来的。
下面是我的一份资料上的问题，你看看有没有帮助。
问：与MBP融合表达的蛋白质与amylose树脂结合时，能用因子Xa切割吗？
答：曾有人做过这方面的研究。但由于存在两个问题，使得此方法不够理想。首先，需要大量的因子Xa，实验发现，切割结合在树脂上的MBP融合蛋白质时需用5％因子Xa作用24－48小时才能获得与1％因子Xa切割溶液状态的融合蛋白质24小时同样的结果。第二个问题是一些MBP在切割温育时与柱子失去结合，可能是由于有微量淀粉酶结合到柱子上，并且逐渐释放出足够量的麦芽糖，最终导致MBP被洗脱。



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