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标题: 【求助】蛋白诱导 [打印本页]

作者: @STAR@ 时间: 2014-2-8 09:46 标题: 【求助】蛋白诱导

我在做蛋白诱导，载体是pET32a,目前诱导温度是37度，IPTG最大浓度到5mmol/L,但是诱导结果不太理想，主要是量比较小，请问大家，IPTG可不可以加大浓度呢？它的作用原理是什么呢？谢谢大家回复啊

作者: yueban-1147 时间: 2014-2-8 10:02

晕，5M浓度已经很高了啊，高浓度IPTG对菌生长是有影响的。
建议降低IPTG浓度，适当降低诱导温度，延长诱导时间。
至于原理，记得好像是IPTG可以解除阻遏蛋白的功能，从而诱导转录开始。
你可以去网上查下专业的解释。

作者: @STAR@ 时间: 2014-2-8 10:04

谢谢啊，我的IPTG终浓度是5mmol/L,这个浓度也很大吗？实验室有的人告诉我要加到终浓度2mol/L呢，我没敢加，我今天再试一试别的温度。

作者: yueban-1147 时间: 2014-2-8 10:04

晕哦！怎么可能！我们的储备液才是1M的，2M怕是都难融！
严重鄙视如此不负责人的人！
你从1mM或500uM往下试。应该没问题。

作者: @STAR@ 时间: 2014-2-8 10:05

我今天做了0.2mM,0.5mM，1.0mM的，看看今天结果怎样

作者: DONT 时间: 2014-2-8 10:05

我们都用0.5mM的,2M还能诱导吗,细菌都被杀死了,IPTG有毒性的.

作者: @STAR@ 时间: 2014-2-8 10:06

IPTG诱导蛋白表达的话，一般有下面几个问题：
1.诱导时机，也就是诱导的菌浓。诱导越晚，菌量越大，容易获得高密度；但相对菌体越老，表达蛋白的时间下降，表达量就可能下降。而诱导得早则菌体密度低，细菌从生长阶段进入表达阶段之后，生长减缓，虽然表达时间延长了，但由于总密度低而导致蛋白表达量不高。因此需要对你得菌以及蛋白做个分析，对诱导时机作出合理得选择。
2.诱导剂IPTG的浓度。IPTG的浓度与蛋白表达的速度相关（其本质应该是转录速度加快了吧？），高浓度表达快，低浓度表达慢。但是IPTG同时具有一定的细胞毒性，浓度越高，对细胞的活性越不利。另外，表达速度越快，蛋白越容易形成包含体。常用的浓度在0.1mM到1mM，也有更多或更少的。
3.诱导温度。一般来说，发酵都分为两个阶段即生长阶段和生产阶段。生长阶段用于菌体生长，一般取比较丰富得培养基和适宜的条件来获得最大的比生长速率；而生产阶段也就是诱导表达阶段，一般换做限制性培养基（E.coli一般不换），降低温度来延缓细菌的生长，延长蛋白表达的时间，从而增加外源蛋白质的表达。同时降低温度也可以在一定程度上减少包含体的形成，一般从30度到24度，最低也有18或16度的。
总得来说建议你降低IPTG浓度，同时降低诱导温度，两个条件都可以做一个梯度实验。同时延长一下表达时间。

作者: xue258 时间: 2014-2-8 10:07

请问楼主用的表达菌是BL21么？如何检测蛋白的表达？是page电泳么，请问上样样品是如何处理的啊？

作者: youyou99 时间: 2014-2-8 10:08

检测蛋白的表达，只需要将诱导的细菌直接加入loading buffer，高温煮沸裂解，同时做一管没有诱导的菌做阴性对照，裂解后的菌体离心，上清和沉淀分别SDS-PAGE检测，如果诱导成功就可以明显看到诱导后的细菌在目的蛋白处条带明显比对照粗

作者: @STAR@ 时间: 2014-2-8 10:09

我们实验室是将菌体12000转离心5分钟，弃上清，加入100ul Tirs-cl(pH6.8)重悬沉淀，再加入5*SDS loading buffer,煮沸10分钟，跑SDS page胶看蛋白表达量，同时做非诱导菌和空载体诱导与非诱导作对照。

作者: @STAR@ 时间: 2014-2-8 10:14

我觉的说的很有道理，我会按照你说的方法优化诱导条件

作者: @STAR@ 时间: 2014-2-8 10:14

今天我用1.0mM的IPTG诱导的，发现随着时间延长菌体没有明显的增多，是不是因为IPTG浓度大了，抑制菌体增殖呢？我是不是应该降低诱导剂浓度呢？还有我是在18度诱导的，是不是低温也会影响菌体增殖呢？

作者: huifeng0516 时间: 2014-2-8 10:15

低温肯定降低细菌生长速率，而加入IPTG以后菌体生长也是必然会受到抑制。这一方面来自IPTG的细胞毒性，另一方面来自自身能量和物质的分配。诱导开始以后，在同样的比消耗速率下（也就是吸收相同的碳源氮源等等），要分出一大部分来生产外源蛋白，细菌还能利用多少营养来繁殖自己呢？所以“菌体没有明显增多”是正常的。
如果你做过生长曲线，特别是发酵的生长曲线，就会很清楚了。建议做一下，OD对time，或者湿重对时间作图。一般做发酵的，特别是发酵调控的话，这个是必须的。
关注两点。
一是你在什么时候加诱导剂。在OD的多少时候诱导，可以取决于你的蛋白对细胞有无毒性，是否会影响到细胞的增殖。
二是诱导多长时间。也就是下罐的时间，对于摇瓶来说就是收菌的时间，取决于你的细胞什么时候老化死掉，或者你的蛋白什么时候开始降解。因此需要对诱导之后每隔一段时间（比如1－2小时），取样，最后把所有的样品一起做SDS-PAGE，一般可以看出你的目标蛋白随着时间在增加，到某个时间达到最大，然后开始降解，从而优化你的发酵时间。

作者: tangxin_80 时间: 2014-2-8 10:16

我在OD值0.5的时候加的诱导剂，37度诱导，从2.5小时开始取样，每隔1小时取一次样，共取了5个时间点的样，但是感觉蛋白的量没有太大变化。我的IPTG是1mmol/L,是不是浓度大了？

作者: pengke1983 时间: 2014-2-8 10:16

我在OD值0.5的时候加的诱导剂，37度诱导，从2.5小时开始取样，每隔1小时取一次样，共取了5个时间点的样，但是感觉蛋白的量没有太大变化。我的IPTG是1mmol/L,是不是浓度大了？
不知道你用的是什么菌，37度温度太高了，试试30度与25度。IPTG的终浓度是由你构建的质粒载体决定，比如pet系统。

作者: @STAR@ 时间: 2014-2-8 10:17

我用的表达菌是BL21，载体是pET32a，刚开始我用37度诱导，IPTG是1mmol/L，诱导出来了，做western结果也正确，但是后来再按照这个条件做就做不出来了，不知道是什么原因。还有就是抗生素的浓度对表达有影响吗？

作者: 小郭郭郭郭郭 时间: 2023-7-21 14:35 标题: 回复 #16 @STAR@ 的帖子

我也是，第一次诱导出来了过表达很好，后来同样的条件就做不出来了，是哪里出了问题啊

作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-22 16:51

在蛋白质表达中，IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）是一种常用的诱导剂。它的作用是激活负责转录目标基因的T7启动子，从而促使目标蛋白的表达。

IPTG的作用原理如下：

1. T7启动子：在pET32a载体中，负责转录目标基因的启动子是T7启动子。在没有IPTG存在时，T7 RNA聚合酶无法结合在T7启动子上，因而无法启动目标基因的转录。

2. IPTG的作用：当加入IPTG时，它能与T7 RNA聚合酶结合，形成IPTG-T7 RNA聚合酶复合物。这个复合物与T7启动子结合并激活转录，从而导致目标基因的mRNA合成。

3. 目标蛋白表达：mRNA进一步被翻译成目标蛋白，使其在细胞内表达。

关于增加IPTG浓度的问题：

在一般情况下，增加IPTG浓度可能会增加目标蛋白的表达水平。但是要注意，过高的IPTG浓度可能会导致细胞内的毒性效应，对细胞造成损伤，从而影响蛋白的表达。因此，建议进行一系列IPTG浓度的优化实验，找到适宜的IPTG浓度，以提高蛋白的表达量。

此外，蛋白表达的成功也与其他因素有关，比如诱导温度和诱导时间等。您可能需要调整这些参数以优化蛋白表达效率。

总结：IPTG是一种常用的蛋白表达诱导剂，通过激活T7启动子促进目标蛋白的表达。在使用IPTG时，建议进行浓度的优化实验，找到适宜的IPTG浓度，同时也需要考虑其他因素的影响，以提高蛋白表达量。

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作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-8 14:42

蛋白质诱导是一种常用的方法，用于在大肠杆菌等表达系统中产生目标蛋白质。IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）是一种人工合成的分子，用于诱导蛋白质表达。它通过模拟大肠杆菌中的内源性信号分子（如乳糖）来激活载体中的启动子，从而促使目标基因的转录和翻译。

在IPTG诱导中，通常的操作是将大肠杆菌细胞在感兴趣的生长阶段添加IPTG。IPTG的存在会激活载体中的lacUV5启动子，进而促使目标基因的表达。通常情况下，IPTG浓度为0.1-1 mM即可实现诱导效果。

但是，过高浓度的IPTG可能会导致一些问题。例如，高浓度的IPTG可能导致大肠杆菌细胞感受到毒性压力，从而影响细胞生长和表达。此外，高浓度的IPTG还可能导致目标蛋白质的不正常折叠或聚集，从而影响其产量和纯度。

如果你的诱导结果不理想，考虑以下几点可能有助于改善实验效果：

1. 时间点的选择： IPTG的添加时间点可能影响蛋白质表达。通常在细胞进入对数生长期后添加IPTG效果较好。

2. 浓度的优化：尝试不同浓度的IPTG，通常0.1-1 mM范围内即可实现适当的诱导。

3. 温度的调整：考虑尝试不同的诱导温度。有时，将温度降低至30°C或提高至42°C可能会改善表达效果。

4. 细胞菌株的选择：不同的细胞菌株对IPTG的响应可能不同。尝试使用不同的细胞菌株也许能改善表达效果。

5. 考虑亲和标签：将目标蛋白质与亲和标签（如His标签）融合，有助于提高目标蛋白质的产量和纯度。

6. 蛋白质的毒性和折叠：如果目标蛋白质有毒性或易于错误折叠，适当的IPTG浓度和诱导时间可能需要调整，以减少对细胞的不良影响。

最重要的是，优化蛋白质表达是一个试错过程，需要综合考虑不同因素的影响。建议进行一系列的实验，根据实验结果逐步调整IPTG浓度和诱导条件，以获得最佳的蛋白质表达效果。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-18 16:59

IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）是一种人工合成的化合物，用于诱导原核生物中的蛋白表达。它可以模拟天然的半乳糖诱导系统，激活载体中的T7或T5启动子，从而促使目标蛋白的表达。

IPTG的作用原理是通过结合重组表达载体上的启动子，释放出基因表达所需的蛋白质转录和翻译机器，从而实现目标蛋白的过量表达。IPTG在一定程度上模拟了细菌在自然环境中遇到半乳糖的情况，从而诱导目标基因的表达。

关于IPTG的浓度，通常5mmol/L是常用的浓度范围，但实际使用时可以根据具体的实验情况进行调整。如果你的诱导效果不理想，可以尝试以下几种方法：

1. 调整IPTG浓度：尝试增加IPTG的浓度，但要注意过高的浓度可能会引起毒性或影响细菌的生长。适当地增加浓度后观察是否有改善。

2. 调整诱导时间：有时候延长诱导时间可以提高蛋白表达量，但也要注意过长的诱导时间可能导致过量表达引起问题。

3. 调整诱导温度：尝试在不同的温度下进行诱导，有时候降低诱导温度可以增加蛋白的溶解度和稳定性。

4. 优化培养基和生长条件：确保培养基成分和生长条件适合目标蛋白的表达。一些蛋白可能需要特定的培养条件。

5. 使用不同的载体和宿主菌株：不同的载体和菌株可能对蛋白表达有不同的影响，尝试不同的组合。

最终的诱导条件需要根据你的实验目的、菌株特性和蛋白性质进行优化。最好在实验过程中进行多次尝试和探索，结合实验结果进行调整。如果实验效果仍然不理想，也可以考虑寻求实验室同事或导师的意见。

作者: 15623267008 时间: 2023-9-23 18:44

想问下各位大佬，我的四个蛋白基因，有一个表达量很低，我试了一系列关于IPTG浓度，添加时的OD值，诱导时间，诱导温度。但是表达量仍然很低，想问下除了以上几个条件以外，还有哪些条件会影响蛋白的表达量啊？我用的也是pet28a的质粒，bl21的菌株。我另外三个有两个的表达量蛮高的，还有一个表达量也还行。

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