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标题: 【求助】包涵体溶解不好 [打印本页]

作者: xevin 时间: 2014-2-8 12:36 标题: 【求助】包涵体溶解不好

我的包涵体在8M尿素中溶了1个多小时，仍然有混浊，没有达到清亮的程度，以前不是这样的。溶解不好，电泳条带就很窄很淡。难道说包涵体中还有其他不溶于尿素的东西？会是表达的问题吗？
很急！请大家帮助我！谢谢

作者: vcve 时间: 2014-2-8 12:36

很有可能你的核算没有除干净，可以尝试用2%的脱氧胆酸钠（NaDOC）来洗包涵体

作者: xevin 时间: 2014-2-8 12:36

我是现超声到没有粘稠，然后离心，去掉上清，沉淀用包含PBS,EDTA和TRITON的洗液洗两三次，得到的较干净的包涵体，然后再用尿素溶。这样操作有不合适的地方吗？
能不能说具体点，2%的脱氧胆酸钠（NaDOC）能不能加到上述洗液中？具体终浓度是多少？我加一些巯基乙醇行吗？为了让蛋白充分溶解。
还有就是这个蛋白做小量时条带很浓，一做大量条带就淡了，除了溶解的问题外会是表达的问题吗？但是我做大量时的表达条件和小量一致啊，包括诱导时机，诱导浓度和诱导时间。拜托指教

作者: xevin 时间: 2014-2-8 12:37

我今天用巯基乙醇试着溶了一下，离心后还是有大量沉淀。真不知是怎么回事？
拜托哪位牛人帮帮我吧。

作者: cbou876 时间: 2014-2-8 12:37

说说我的办法：
1.可以考虑适当的提高一下溶解温度，比如30度~40度，当然也要看蛋白的耐受情况了；
2.延长溶解时间，1小时似乎短了一些；
3.可以适当调节一下溶解液的pH，比如在弱酸条件下溶解不好，可以试试8.0左右的弱碱环境。

作者: xevin 时间: 2014-2-8 12:37

谢谢！我实验室有另外一个同学，她的蛋白就在常温下，不到半小时就能溶解的很好，很清澈，离心后只有很少的沉淀，我的蛋白跟她的相差很大，不知是不是蛋白的个体原因？
前两个方法我试一下，至于第三个方法，尿素本来就是弱碱的吧，可能不用调ph.
还有就是用适当提高溶解温度具体怎么操作呢？把蛋白置于加热到25度的水中吗？
真的很郁闷，蛋白溶不了，下面工作没法开展，卡在这儿前进不了，急需帮助！

作者: bananapeople 时间: 2014-2-8 12:38

尿素溶解不了，那就试试盐酸胍。

作者: xevin 时间: 2014-2-8 12:39

但是用盐酸胍溶以后不能上离子交换柱吧

作者: xevin 时间: 2014-2-8 12:40

楼上站友建议我提高温度，但是提高温度会不会使尿素分解啊？

作者: wmp1234 时间: 2014-2-8 12:40

我现刚开始做细胞每次盖子都是朝上放的然后在酒精灯上过一下没见什么污染

作者: kuohao17 时间: 2014-2-8 12:40

可能还是包涵体没洗干净，我记得以前有人发过，参考一下。蛋白表达小量与大量条件有些不同，特别是溶氧。

作者: cbou876 时间: 2014-2-8 12:41

就我的了解和经验，和紫菁战友讨论一下，期望能共同进步。
1.蛋白个体差异的确很大，可能层析的过程研究的相对较多，而层析前的处理方法关注的比较不够，应该说包涵体洗涤和溶解对最后的层析收率影响是很大的，甚至超过层析条件的影响。
2.至于加热溶解的方法，可以水浴锅加热，然后使用小的搅拌装置就行，也可以用水浴摇床或是可空气加热的摇床。
3.尿素溶液可以用盐酸调到5.0~6.0的pH后溶解包涵体试试，也许有用。当然，这的确是和蛋白性质有关。
4.尿素高温和长时间中温会分解，使溶液浓度降低，而且生成的氰酸跟还会不可逆的修饰蛋白，有时会导致失活，故即便提高溶解温度，也不要高于30度。30度以内应该是安全的。
5.如果提高温度有效果的话，便忘了层析全过程都要保持温度，防止蛋白沉在柱子里。
祝好运！

作者: luoliqiong 时间: 2014-2-8 12:41

盐酸胍溶解包涵体后，确实不能直接上离子柱，但是如果蛋白有His6的话，可以用镍柱啊。如果没有，可以复性后（此时离子强度要很低，盐酸胍浓度不要超过50mM），可以过离子交换柱。
如果非要在变性的条件下过离子交换柱，那么可以尝试用sarkosyl（N-十二烷基肌氨酸钠），这是一种阴离子去垢剂，溶解包涵体的推荐浓度是0.1%-1%，这样，你就可以选择一个合适的浓度来溶解你的包涵体。辅以温浴，超声（温和）都能帮助包涵体的溶解。
不推荐使用尿素，最主要的原因就是它能在碱性条件下能与蛋白发生共价修饰。
你可以去尝试一下，如果还有什么问题，我们可以共同探讨.

作者: standbyme 时间: 2014-2-8 12:42

不同的包涵体由于大小，致密程度，表面状态等差别，在变性方面存在较大的差异，需采用不同的变性剂进行变性溶解．普遍采用两种变性剂：１是盐酸胍，２是尿素．尿素对包涵体的溶解能力不如盐酸胍，只有达到１０Ｍ时才能达到完全溶解，而此时尿素已经达到饱和，容易析出．盐酸胍建议用５－６Ｍ．我现在也在做包涵体的溶解，我用的溶解缓冲液是３mM的ＤＴＴ，６Ｍ　盐酸胍，　２０mM　ＴＲＩＳ－ＨＣＬＰＨ８．０按Ｗ／Ｖ＝１：５体积溶解包涵体．你可以实验一下．还有就是用盐酸胍变性溶解后你可以通过脱盐后上离子交换柱．这样就可以将变性剂除去．

作者: xevin 时间: 2014-2-8 12:42

我前天试了一下，加温用处不大，尿素和盐酸胍都把ph调到8-9，溶液立即从混浊变为澄清。跑了下电泳，量很大。困扰了我很久的问题终于解决了，非常感谢大家！看来实验就是要摸索啊！
不过我还没试过将ph调到5-6能不能溶，回头试一下。
还有两个问题，希望各位站友帮忙解答下：
1.巯基乙醇和DTT是不是都能用来增溶啊？哪个比较好呢？
2.如果用尿素溶，ph调到8-9会不会影响上阳离子交换柱呢？因为阳离子交换柱不是低ph上柱，高ph洗脱吗？

作者: xevin 时间: 2014-2-8 12:42

我想起来，如果把ph调到8-9，再调到5-6，然后上sp柱，不知这样行不行，ph应该是满足要求了，但是由于用NaoH和HCl调的，会提高离子强度，如果我稀释下不知上sp柱行不行？
请各位高手指点！

作者: fsdd817 时间: 2014-2-8 12:43

ph调到8-9时候蛋白溶解性很好，但是如果再调到5-6，可能会沉淀吧？

作者: xevin 时间: 2014-2-8 12:44

那怎么办呢，怎么也要上sp柱啊，不然怎么纯化啊？因为上镍柱拖尾太长了，效果不好

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