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标题: 【讨论帖】讨论:有关跨膜蛋白问题,敬请高手参与! [打印本页]

作者: applebook=213    时间: 2014-2-8 13:03     标题: 【讨论帖】讨论:有关跨膜蛋白问题,敬请高手参与!


本人手头有一基因,用TM-Pred software (cuturl('http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html'))预测出来有4个跨膜螺旋,但是使用细胞亚定位(同pEGFPN3融合)发现在细胞核和细胞质中都有表达。
现在望高手参与讨论把:
1.存在跨膜螺旋的蛋白就一定是跨膜蛋白吗?
2.跨膜螺旋的蛋白就一定不能在细胞核和细胞质中表达吗?
3.如何自圆我说,预测的跨膜螺旋并不影响其在细胞核和细胞质中表达?
因为老外编辑紧抓此问题不放,原文如下:
Best my knowledge, there is no report that transmembrane protein can be localized everywhere including nuclei in the cells without protein processing.
想从存在跨膜螺旋的蛋白就不一定是跨膜蛋白入手,但没有合适的佐证,能有文献支持作好!

作者: 箭头儿    时间: 2014-2-8 13:03


我们实验室也做了一部分生物质膜的工作, 这里和楼主共同探讨一下
1. 存在跨膜螺旋的蛋白应该就是跨膜蛋白,但跨膜蛋白不一定都有α-螺旋,因为还有一类革兰氏阴性菌, 线粒体和叶绿体外膜蛋白是以β -折叠形成 β barrel。
2. 跨膜螺旋的蛋白可以在细胞核和细胞质中表达, 存在于核膜或者转录过程中存在也是可以理解的, 除开某些亚细胞器的标志蛋白, 其他的膜蛋白的表达和存在领域其实是很广的。

作者: applebook=213    时间: 2014-2-8 13:03



QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2014-2-8 13:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们实验室也做了一部分生物质膜的工作, 这里和楼主共同探讨一下
1. 存在跨膜螺旋的蛋白应该就是跨膜蛋白,但跨膜蛋白不一定都有α-螺旋,因为还有一类革兰氏阴性菌, 线粒体和叶绿体外膜蛋白是以β -折叠形成 β barrel。 ...

谢谢您的参与!你所讲跨膜螺旋的蛋白可以在细胞核和细胞质中表达不知道有否文献之类的证据否?若有,望能提供些。谢谢!
作者: 小糖块    时间: 2014-2-8 13:04


的确,通常来说,存在跨膜螺旋的蛋白的确很少在胞质中的。
建议楼主用pEGFPC载体融合地位一下。有时N载体会通过改变蛋白的结构,从而影响定位。如果如楼主所说存在四个的话,的确有些不太可能。

作者: 小糖块    时间: 2014-2-8 13:04


不过有点是肯定的,TM-Pred software软件预测肯定是会出现差错的,有些普通的螺旋也会被预测成跨膜螺旋的。

作者: remenb    时间: 2014-2-8 13:04


1 蛋白在细胞核和细胞质中都有表达,仅仅是GFP定位(在荧光显微镜下观察)的么?还是由WB检测到目的蛋白的?我曾经碰到过不稳定蛋白融合后出现截短表达的情况,只表达了载体上的蛋白,而目的片断未表达
2 融合蛋白有可能改变目的蛋白结构,那样的话,定位就不准确了

作者: applebook=213    时间: 2014-2-8 13:05



QUOTE:
原帖由 remenb 于 2014-2-8 13:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1 蛋白在细胞核和细胞质中都有表达,仅仅是GFP定位(在荧光显微镜下观察)的么?还是由WB检测到目的蛋白的?我曾经碰到过不稳定蛋白融合后出现截短表达的情况,只表达了载体上的蛋白,而目的片断未表达
2 融合蛋白有可能改变目的 ...

是GFP定位的,没有做WB检测到目的蛋白,暂时没有制作抗体.你所说只表达了载体上的蛋白GFP,现在编辑argue为表达部分GFP,但是我的基因2K左右,融合在GFP前,如因为后边ATG的第二次翻译,效率应该很低的,但是定位表达结果为均匀分布质\核内,假若目的基因为非均匀分布质\核内,观察结果应该在亮度上有所差异,但是结果为均匀分布.
融合蛋白有可能改变目的蛋白结构,但是作为商业性载体的pEGFP-N3肯定考虑到,所以用抗体结果最好,但是目前无,我的意思是在这个前提下如何提出一些可行的证据如文献等argue下编辑,让其打消疑虑.

作者: lixi559    时间: 2014-2-8 13:05


老外说的有道理,如果没有剪接加工的话,膜蛋白确实是不应该在核里面看到的。我们也做过几个膜蛋白的定位,没有在核里面看到表达的。呵呵,这个应该在投稿的时候就有思想准备的。
针对这个问题,个人意见:因没有抗体,可以用GFP抗体做一WB,检测下表达的融合蛋白(分别用pEGFP-N和pEGFP-C来做)的分子量,看是不是有截短现象。
如果有截短并且在细胞膜和细胞核都可见表达,就可以解释了,而且还是新东东,呵呵。
如果WB发现没截短,而且只定位在细胞膜,那就可能是由于GFP定位的artificial现象了。
还有一种可能:WB发现没截短,而且在细胞膜和细胞核都可见表达,那就不好解释了,还需要深入的实验进行验证到底是怎么回事。供参考。

作者: 8princess8    时间: 2014-2-8 13:06



QUOTE:
原帖由 applebook=213 于 2014-2-8 13:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

本人手头有一基因,用TM-Pred software (cuturl('http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html'))预测出来有4个跨膜螺旋,但是使用细胞亚定位(同pEGFPN3融合)发现在细胞核和细胞质中都有表达。
现在望高手参与讨论把:
1.存在 ...

首先说一点预测的东西不能全信
1存在跨膜螺旋的蛋白不一定是跨膜蛋白,一般预测的都是alpha螺旋的结构,和跨不跨膜没必然关系。所有跨外膜蛋白(包括细菌外膜和线粒体叶绿体外膜)都以beta-barrel结构穿膜但也可能在末端存在alpha螺旋游离或插在barrel中间,其他跨膜蛋白都是以alpha螺旋作为穿膜结构的。但是alpha螺旋和beta折叠是蛋白质二级结构在所有蛋白中都可能存在
2所有transmembrane protein在成熟前翻译后基本上会和chaperon结合的,在这段时期,会可能有部分二级结构存在(这点好像和你的问题无关)
3你的亚细胞定位的结果更solid,说明你的目的蛋白不是穿膜蛋白,不明白你为什么要把它说成穿膜蛋白呢?

作者: applebook=213    时间: 2014-2-8 13:06



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原帖由 lixi559 于 2014-2-8 13:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老外说的有道理,如果没有剪接加工的话,膜蛋白确实是不应该在核里面看到的。我们也做过几个膜蛋白的定位,没有在核里面看到表达的。呵呵,这个应该在投稿的时候就有思想准备的。
针对这个问题,个人意见:因没有抗体,可以用GFP ...

好见解!赞一个!老外编辑就是建议这样确认下,因为文章投稿只是个小文章,同时涉及以前的实验,现在也无法再深入做下出(工作原因),所以才投稿到小杂志上,所以不想再用GFP抗体做WB,只是从写作技巧上弥补达到,从现有文献中引用支持本论.从写作技巧上,还有难度,难道真成死结了吗?
作者: applebook=213    时间: 2014-2-8 13:07



QUOTE:
原帖由 8princess8 于 2014-2-8 13:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')



首先说一点预测的东西不能全信
1存在跨膜螺旋的蛋白不一定是跨膜蛋白,一般预测的都是alpha螺旋的结构,和跨不跨膜没必然关系。所有跨外膜蛋白(包括细菌外膜和线粒体叶绿体外膜)都以beta-barrel结构穿膜但也可能在末端 ...

"存在跨膜螺旋的蛋白不一定是跨膜蛋白",这也是我想支持的论点!8princess8战友有否类似的文献证据?因为要argue老外编辑,还是想有文献证据为好!亚细胞定位的结果说明不是穿膜蛋白,但是老外编辑直接认为是跨膜蛋白,个人也没有下此结论,只是文章中预测为跨膜螺旋,如果又说其不是跨膜蛋白或预测错误,岂不自己打自己耳光?且目前没有类似证据证明"存在跨膜螺旋的蛋白不一定是跨膜蛋白",还望8princess8战友继续提供信息,谢谢!
作者: c86v    时间: 2014-2-8 13:12


对蛋白预测方面了解不多,就我所知yuner应该比较权威,我经常向他请教,可参考
就本人理解,
1。预测的不一定准确,只有实验了才能确定是否是跨膜的;
2。螺旋结构,也就是亲脂的结构,该部分是否跨膜?我知道有些蛋白有两个跨膜区,但是有3个亲脂区,其中一个亲脂区不跨膜但是靠近膜结构,但是有亲脂结构却不跨膜的没见过(但不代表没有吧);
3。跨膜蛋白是否影响亚细胞定位,没见过文献,就个人理解,跨膜结构无非是亲脂,核膜是否也算亲脂部分?可否跨核膜,也就是核转录因子之类的蛋白?
4。以上只是一些讨论与假设,楼主的问题已无法用实验去进一步验证,而是希望发表文章,所以都是仅供参考,列一些解释看能否说服Reviewer,欢迎大家讨论!

作者: yjf1026    时间: 2014-2-8 13:12


讨论的好激烈呀,俺以前没做过蛋白质定位的实验。但是初初看了一下TM-Pred 的结果,存在几个疑问。感觉TM-Pred 主要预测你的蛋白有可能存在多少个跨膜的螺旋区,预测本身并没有做一个预判断说你的蛋白是不是跨膜蛋白,只要存在类似的螺旋区,是不是都有可能被认为是跨膜蛋白呢?你可以拿一个胞内蛋白的序列做一个预测,看看结果是什么样的。
另外建议可以先用TMHMM(cuturl('http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/')),结合一级结构的疏水性分析先看看你的蛋白是不是一个跨膜蛋白。


图片附件: 37945068.jpg (2014-2-8 13:12, 25.07 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=22945


作者: ukonptp    时间: 2014-2-8 13:13

今天一上来发现这么多高手参与了讨论, 获益良多
1. 关于上面有人说的存在跨膜结构的不一定是膜蛋白, 因为预测结构是存在偏差的, 这个我持保留意见, 因为楼主预测出的不是1-2个跨膜区, 而是4个, 这个应该还是很SOLID的结果, 如果不放心的话, 可以同时用2006st版主推荐的TMHMM也预测一下跨膜结构域, 通过cuturl('http://swissmodel.expasy.org/') 来预测3级结构, 同时结合GRAVY值的正负来验证目标蛋白是否是膜蛋白。
2. 关于亚细胞定位的问题, 我们一般是用的工具PSORT (cuturl('http://psort.nibb.ac.jp/form2.html'))来预测, 同时用EXPASY的subcellular location来验证, 因为不同数据库的数据的复杂性, 预测出来的膜蛋白结果定位有时候不仅仅会存在于细胞膜上(因为我们在提取细胞膜蛋白之后会整体的做预测和分析, 其中最终定位在膜上蛋白含量能够达到60%-70%左右就算膜蛋白富集成功, 其中难免会有不少疏水性的和有跨膜结构域的没有定位在膜上, 这些在处理的时候我们认为是数据误差或者争议性数据, 承认存在但是在最后筛选的时候还是会剔除)
3. 楼主用细胞亚定位(同pEGFPN3融合)发现在细胞核和细胞质中都有表达这个结果正如前面讨论所说的是非常可靠的, 是否因为目标蛋白发生了一些改变而导致的定位不准确呢?
最后祝愿楼主妙笔生花, 修改成功!

作者: applebook=213    时间: 2014-2-8 13:14



QUOTE:
原帖由 yjf1026 于 2014-2-8 13:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

讨论的好激烈呀,俺以前没做过蛋白质定位的实验。但是初初看了一下TM-Pred 的结果,存在几个疑问。感觉TM-Pred 主要预测你的蛋白有可能存在多少个跨膜的螺旋区,预测本身并没有做一个预判断说你的蛋白是不是跨膜蛋白,只要 ...

同意你所说"预测本身并没有做一个预判断说你的蛋白是不是跨膜蛋白,只要存在类似的螺旋区",之前我已经用TMHMM(cuturl('http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/'))预测过同TM-Pred 预测不一致,而好似TM-Pred 效果更好,所以采用了TM-Pred 预测,如有更好建议,望能提供!谢谢!
作者: qhyu    时间: 2014-2-8 13:14


有跨膜结构,会不会是细胞器的跨膜蛋白,比如:mitochondria,ER等,免疫荧光的现象好像也呈现在胞浆,如果确证需要用特异marker共定位确定。

作者: pengke1983    时间: 2014-2-8 13:15

我觉得楼上说的很有道理,跨膜蛋白的“膜”不一定就是细胞膜吧?核膜也是膜,核孔蛋白应该也是跨膜蛋白的一种吧,所以我觉得这也是正常啊。
本人对这方面知之甚少,是来学习的。

作者: 98776langtao    时间: 2014-2-8 13:16


Could you tell me what can I get from the result of TM-Pred software . The name of the gene is sly-9.
TMpred output for sly-9
[ISREC-Server] Date: Wed Jul 2 13:38:31 2008
________________________________________
tmpred -par=matrix.tab -html -min=17 -max=33 -def -in=wwwtmp/.TMPRED.1276.4779.seq -out=wwwtmp/.TMPRED.1276.4779.out -out2=wwwtmp/.TMPRED.1276.4779.out2 -out3=wwwtmp/.TMPRED.1276.4779.txt >wwwtmp/.TMPRED.1276.4779.err
Sequence: SDS...FVN, length: 148
Prediction parameters: TM-helix length between 17 and 33
________________________________________
1.) Possible transmembrane helices
The sequence positions in brackets denominate the core region.
Only scores above 500 are considered significant.
Inside to outside helices : 2 found
from to score center
58 ( 62) 82 ( 82) 798 71
95 ( 95) 114 ( 114) 104 104
Outside to inside helices : 2 found
from to score center
55 ( 62) 82 ( 82) 952 71
94 ( 94) 114 ( 114) 663 104
________________________________________
2.) Table of correspondences
Here is shown, which of the inside->outside helices correspond to which of the outside->inside helices.
Helices shown in brackets are considered insignificant.
A "+"-symbol indicates a preference of this orientation.
A "++"-symbol indicates a strong preference of this orientation.
inside->outside | outside->inside
58- 82 (25) 798 | 55- 82 (28) 952 +
( 95- 114 (20) 104 ) | 94- 114 (21) 663 ++
________________________________________
3.) Suggested models for transmembrane topology
These suggestions are purely speculative and should be used with extreme caution since they are based on the assumption that all transmembrane helices have been found.
In most cases, the Correspondence Table shown above or the prediction plot that is also created should be used for the topology assignment of unknown proteins.
2 possible models considered, only significant TM-segments used
*** the models differ in the number of TM-helices ! ***
-----> STRONGLY prefered model: N-terminus inside
2 strong transmembrane helices, total score : 1461
# from to length score orientation
1 58 82 (25) 798 i-o
2 94 114 (21) 663 o-i
------> alternative model
1 strong transmembrane helices, total score : 952
# from to length score orientation
1 55 82 (28) 952 o-i
Thank you very much.

作者: applebook=213    时间: 2014-2-8 13:16



QUOTE:
原帖由 98776langtao 于 2014-2-8 13:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

Could you tell me what can I get from the result of TM-Pred software . The name of the gene is sly-9.
TMpred output for sly-9
Date: Wed Jul 2 13:38:31 2008
________________________________________
t ...

1.) Possible transmembrane helices
The sequence positions in brackets denominate the core region.
Only scores above 500 are considered significant.
Inside to outside helices : 2 found
from to score center
58 ( 62) 82 ( 82) 798 71
95 ( 95) 114 ( 114) 104 104
Outside to inside helices : 2 found
from to score center
55 ( 62) 82 ( 82) 952 71
94 ( 94) 114 ( 114) 663 104

作者: pengke1983    时间: 2014-2-8 13:17


It means the protein can be transmembraned, but not very stong? Am I right?
you can use chinese to write.
but I can not use chinese because not chinese input on my computer, i am sorry.
Thank you very much.

作者: pengke1983    时间: 2014-2-8 13:17


But I used another software to check the protien, no transmembrane site;





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