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标题: 【求助】翻译后修饰? [打印本页]

作者: 红茶可乐 时间: 2014-2-12 16:47 标题: 【求助】翻译后修饰?

我在2DE中发现多个HSP27斑点，且位于同一分子量水平线上。我认为存在蛋白质的翻译后修饰现象。但在免疫印迹实验中并未应用特殊的方法提取蛋白（如磷酸化蛋白提取液）。出现了两条带,请帮助解释,谢谢!

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=23013

作者: jkobn 时间: 2014-2-12 16:48

这种情况不一定是蛋白修饰，我们也做过相似的项目，它们应该是异构体，只有在后面纯化中把它分开了！

作者: avi317 时间: 2014-2-12 16:48

''但在免疫印迹实验中并未应用特殊的方法提取蛋白（如磷酸化蛋白提取液）''
有一点是可以肯定的,这不是磷酸化修饰,因为磷酸根的分子量太小了,不足以在SDS-PAGE上区分出来.
HSP27属于小分子Hsp家族,抗体主要针对其约100AA的C-端保守区域,你的胶如果跑得好,可以把这两个条带分得更开点.
有三种解释:
1.Hsp家族以外的蛋白,有着与HSP27C-端保守区域一样的AA序列,所以也被抗体识别了.我用GAPDH的单抗也出来两条带呢.小分子HspC-端保守区域与χ-晶体蛋白有很高的同源性.
2.两个热激基因编码的HSPs,都属于小分子Hsp家族,同源性较高,也有可能.大鼠Hspb1基因编码 23KD 的HSPB1和Hspb8基因编码 22kd的HSPB8,但这两个只有百分之四十几同源性.
3.异构体,如小鼠HSPB1两个isoforms,一个197AA,一个209AA.
我给你一篇文章,他的结果和你类似,也有两条带,
这只是个人意见,欢迎大家继续讨论.

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2014-2-12 16:49

在楼上精彩分析之上，我也补充一下
1 不像是非特异性条带（由其他蛋白引起的，但二者分子量如此之近，而且张膜都很清晰，可能性不大）
2 觉得异构体的可能性大（平均一个氨基酸分子量100多一点，差几个就凑够了）
3 尚不能就此排除翻译后修饰现象。
楼主先说明一下抗体的性质（单抗？），查一下HSP27是否有磷酸化位点。如有，请说明磷酸化位点的个数、性质（丝氨酸/酪氨酸/苏氨酸），在何种情况下磷酸化并结合你的实验（如超过3个位点要考虑磷酸化修饰，一个磷酸化分子量增加80，不可能引起蛋白分子量明显改变，5个左右就有0.4k了，5个同时磷酸化在恰当分辨率的胶上亦可有所表现，不一定会被磷酸酶破坏）。否则可以排除磷酸化。

作者: avi317 时间: 2014-2-12 16:49

的分析很周全.真棒!
1.我觉得异构体的可能性最大,所以把它写在最后一点
2.不知道楼主做的是来源于什么物种什么组织什么细胞的HSP27?!
不同来源的HSP27蛋白可能磷酸化位点也不一样,我目前知道有三个位点,SER-15,78,82,这是我排除磷酸化修饰的原因.而且就就算有5个位点,0.4KD,那也够呛,在普通的SDS-PAGE上也是分不出来的,
3.看过其他文献上的HSP27,好多也有双带出现的,但是分的没这么近,我怀疑楼主跑胶是不是跑的不够开,但楼主说:''在2DE中发现多个HSP27斑点，且位于同一分子量水平线上。''
不知道楼主能不能把2D图传上来看一下.

作者: cj_mondy 时间: 2014-2-12 16:50

我只想说
极大可能是PTM
我也有类似的文章在投不过很不幸，有个审稿人（利益冲突投稿时没排除这人）鸡蛋里挑骨头 MD
虽然不知道具体的PTM方式（汤剂化磷酸化等）但一个蛋白质却容易发生PTM，具体表现在 2D胶上有很多个点（Mw一样 pI不同）均是一个蛋白质；
证明方式也很简单 2DE＋WB

作者: eric930 时间: 2014-2-12 16:51

继续补充
几个点都做过质谱的，全是HSP27，匹配率有多高？出现几个点，PI相差有各有多少？
也希望能看到2D图，或者用语言描述一下，以便分析原因。
另请提供抗体说明书或公司货号（尤其是单抗），以便明确表位存在的范围，如果是单抗，也大有助于分析。
2DE＋WB我倒是见过的，我待的实验室做过相关课题。有一个办法，就是选择已知的专门针对磷酸化位点的抗体去做2DE＋WB，可以确定有无磷酸化。或者专门用糖基化的抗体（我也见过，是楼下实验室做的，好像做糖基化抗体不是专门针对某个蛋白质的，而就是针对糖基的，所有蛋白的糖基都识别，没有深究过）。但还是不能鉴别到底是异构体还是磷酸化等修饰，如果这些磷酸化或者糖基化是几个异构体共有的话。
上次忽略了2D上出现等电点变化，只是从western上进行解释，尚不知异构体是否会导致PI变化，氨基酸确有酸性、碱性及中性氨基酸之分，酸性即一氨基二羧酸（如天冬氨酸、谷氨酸），碱性的即二氨基一羧酸（如赖氨酸）等。
在这方面不专业，确需遇到过类似问题的战友来解答，这是个通遇的典型问题，对实验的价值很大。回去要花些时间学习学习糖基化和磷酸化检测了。
顶一下，向知情战友求助异构体是否会导致PI变化，或者什么方法可以证明异构体?

作者: 红茶可乐 时间: 2014-2-12 16:51

PI 相差我不太清楚,只作了分子量的Marker,没作PI的Marker,但有一段距离
,
HSP27货号:美国Santa Cluz产品:sc1048,5个HSP27斑点,匹配率为47%/74%/49%/60%/47%

作者: eric930 时间: 2014-2-12 16:52

先发个抗体说明书
链接 cuturl('http://www.scbt.com/datasheets_list/sc-1048.pdf')
SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.
HSP 27 (C-20): sc-1048
The heat shock proteins (HSPs) comprise a group of highly conserved, abundantly expressed proteins with diverse functions, including the assembly and sequestering of multiprotein complexes, transportation of nascent polypeptide chains across cellular membranes and regulation of protein folding. Heat shock proteins (also known as molecular chaperones) fall into six general families: HSP 90, HSP 70, HSP 60, the low molecular weight HSPs, the immunophilins and the HSP 110 family. The low molecular weight family includes HSP 10, HSP 20, HSP 27, HSP 32 and HSP 40. HSP 27 is a constitutively expressed cytoplasmic protein that co-localizes to the nucleus upon stress induced by insult. Heat, cytokines and hormones are among the factors that stimulate the synthesis of HSP 27. In vitro, HSP 27 becomes highly phosphorylated following exposure to stress. The discovery that HSP 27 is regulated by hormones such as estrogen has led to studies establishing a relationship between HSP 27 and breast cancer.
SOURCE
HSP 27 (C-20) is an affinity purified goat polyclonal antibody raised against
a peptide mapping at the C-terminus of HSP 27 of human origin.
说明：
1 HSP27组成性表达于胞浆，在损伤信号下入核；亦可被热刺激、细胞因子和激素诱导表达。在体外HSP27暴露于应激信号后高度磷酸化。在贴图中也可以看到刺激后HSP70表达增高并且分子量部分增加（因为不一定所有HSP70几个位点全同时磷酸化，所以条带是下端与未刺激齐平，上端上移，所以条带变宽，这点与1楼的western还是不完全相同的，原因也可能是1楼的图同时磷酸化的比例高，所以2条带截然分开？也不对，2D上有5个斑点呢，说明至少需5个磷酸化位点。）
2 本抗体为亲和纯化后多抗，表位为C端一段肽片段（一般多抗用来区分磷酸化和异构体就没有太大意义了，针对多个表位，不会因为1个磷酸化位点的破坏而失去识别抗原功能。目前已知3个丝氨酸位点,SER-15,78,82,，氨基酸是从C端开始标位的吗？谁来告诉我？要是表位也落在这个区域，又很难讲了）
磷酸化有些眉目，慢慢来，再查查磷酸化位点，以及异构体情况。
这个帖子发了我整整1个小时，发完了才看到搭档也发了帖子。好，dxy要的就是这个氛围。讨论版嘛，百家争鸣，大家都不要胆怯，只要讨论的好，版主理所当然会给加分，何必计较得道与否。这样才有讨论的气氛嘛。都不要后退，大家都畅所欲言，把自己的观点直接提出来，无论是否专业，是否成熟，知识只有更新才有活力，思维是第一位的。
匹配率最小的也接近50％，看来这5个都是HSP27了。另楼主把1楼4个泳道对应的处理因素也说一下，看能否从图中找到点线索，了解你的实验设计，也利于分析结果。
我已在本版色谱老前辈的蛋白纯化置顶帖里把这个情况向老前辈说明了，不知他老对此有无看法，大家静候。
众人拾柴火焰高，大家齐心协力，都来帮帮忙

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=23014

作者: 12xunmei 时间: 2014-2-12 16:52

我对isoform的理解：
1 来自两个以上的同源基因，比如A1 A2 A3三个同源基因，分别对应有A1 A2 A3三个蛋白质，而这三个蛋白质均不存在任何的PTM，也可称为isofrom
2 只有一个基因，对应的蛋白质却存在几种形式，典型的isoform，
来源于蛋白的PTM，如果采用2DE+WB鉴定，则很容易鉴定到整个2DE胶上，存在几个Mw一样而pI不同的几个点，因为一发生PTM，则容易导致该蛋白的pI发生变化；
当然，如果钱够多，现在用MS技术完全可以鉴定出各个isoform发生了什么具体的PTM；理论上，各个isoform肯定有其生物学意义，不过实际上你不知道它具体的生物学意义，你没必要鉴定它吧，虽然先鉴定它可以帮助理解其生物学意义；
只要有抗体，没事作作2DE＋WB 我相信很大部分单基因编码的蛋白均存在类似现象
我的文章很简单，就是用2DE＋WB发现了一个蛋白质具有几个isoform形式，
其中一个为乙酰化且表达量最大；而且在不同的材料中发现了isoform 的
pI漂移，后发现是一个酸性氨基酸突变为碱性氨基酸
MMD 有个审稿人就是不想让我发表

作者: 12xunmei 时间: 2014-2-12 16:53

证明是否磷酸化，
1楼的可以用CIAP（去磷酸化酶，一定要是可以去蛋白质磷酸化的酶）处理一下，再跑单向的SDS PAGE，再用anti－HSP27 WB一下，则可以说明问题
很多文献都是这么作的，
不过别人要证明是否磷酸化/去磷酸化，一般来说都是具有和什么现象相关联的功能，
为了证明存在磷酸化而去作去磷酸化处理 WB鉴定，没多大意思（个人觉得）

作者: loli 时间: 2014-2-12 16:54

If you could cut the bands from SDS-page, proteins could be extracted from the gel. Their accurate molecular weights could be measured using QTof or LCT with lock mass. phosphorylation could be found from molecular weight difference.

作者: tangxin_80 时间: 2014-2-12 16:54

情邀请,实在不很清楚这个个问题,大家讨论都很有意思,只说说自己的想法,这样很近的两条带其实可能出现的情况不外乎有以下几种情况,1降解,2自己身修饰,但是具体哪种情况需要去排除才好,糖基化或者磷酸化都会导致电泳的异常,其实有时候并非距离远就不可能是磷酸化,个人意见,只供参考.

作者: IAM007 时间: 2014-2-12 16:55

不象降解的条带.
极大可能还是磷酸化.要证明是否磷酸化有三个法子:
1.楼上所说的去磷酸化处理,但楼上自己也说了:''为了证明存在磷酸化而去作去磷酸化处理 WB鉴定，没多大意思（个人觉得）''
2.我已经说过的,做个glycerol-urea electrophoresis,让各种states在同一块胶上跑出来,用普通的抗体杂,如出四五条带基本上可以肯定是phosphorylation了.进一步可以用一种磷酸化抗体验证.
3.放射磷标,跑2D,显影.说不定五个点都是磷酸化修饰,应了DD所说的''5个同时磷酸化在恰当分辨率的胶上亦可有所表现''.那么SDS-PAGE的表现就有一个很perfect的解释了.
楼主,你做HSPs这块的,我们毕竟门外汉,不熟,你来说说.

作者: avi317 时间: 2014-2-12 16:56

对我的目前观点做个了结，算是告一段落，但还是希望这个帖子还会有活力。
1．磷酸化修饰也是引起isoform的一种，HSP27归属此类。
2．人HSP27根据等电点的不同（为磷酸化引起）分为HSP27A，HSP27 B, HSP27 C, HSP27D 4个异构体，未磷酸化的为HSP27A，占正常未诱导情况下的90％，PI约为6.8。有的因素可促进HSP27转录；有的因素刺激下HSP27A磷酸化后转变为HSP27 B、HSP27 C、HSP27D，HSP27总量不变，故为翻译后修饰。因伴有磷酸化并且比HSPA偏酸（至于后面3个异构体是不是仅由磷酸化引起而无其他因素参与，我没有查到专门的讨论，但根据资料考虑异构体就是磷酸化引起的。）不同因素处理HSP27磷酸化的位点个数也不同。
3．人HSP27有3个磷酸化位点均为丝氨酸，分别为Ser15, Ser78, and Ser82.我没有查到更多的磷酸化位点的报道，就这3个，3个都磷酸化总共增加0.24kd，可以引起分子量的改变，并在western上有所体现（～28kd＋0.24kd，接近0.9％的差异，也不小，这个分子量我估计要12％或以上的分离胶完全可以分离，15％左右的胶效果更好）。
4 对磷酸化导致的等电点改变有2种解释：这两种观点只有一种可能，但我没有查到支持任一观点的任何资料，请熟悉磷酸化的战友前来助阵。
a．1个磷酸化位点（无论哪一个）对应1个PI，则2D上有未磷酸化、1个磷酸化、2个磷酸化、3个磷酸化共4个点。不能解释2D上分子量完全一致（实际2D差几百个分子量还是看不出来的）及5个点（要不就是你发现除此3点之外新的位点？或者是Uuuuuuuu提出的突变？）。也不能解释western上2条带。（除非这样解释：以未磷酸化和n个磷酸化为主要，故其他几个磷酸化在western上没有显示）。
b．3个位点的磷酸化各对应1个PI，排列组合后，未磷酸化1个点，1磷酸化3个点，2磷酸化3个电，3磷酸化的1个点，2D上最多有8个点的可能（这种解释从道理上好像讲不通，不同位置的同一氨基酸加了同一磷酸根，怎么会PI不同呢？）。用某些磷酸化信号低2D及western不能显示就可以基本解释所有现象了。
5．蛋白质从N端开始标号，人HSP27编码199AA，磷酸化最大在Ser82，抗体识别C端，故磷酸化对抗体识别没有影响。尚需知道磷酸化后PI是变大还是变小。这个对解释也很重要。文献说HSP27 B, HSP27 C, , HSP27 D伴有磷酸化并且比HSPA偏酸，推测磷酸化后PI变小。
6．目前我尚未见有关HSP27糖基化的报道。
7．也未见有关AA序列变化（翻译前引起,比如PremRNA不同剪接方式）引起的异构体导致分子量差异及相关报道。
8．很多文献western上HSP27都有2条带的，所以还是考虑HSP27本身的因素引起的。当所有解释都无法行通时，尚不能排除因为抗体非特异性引起的western杂带（迫不得已再用此解释，或者用磷酸酶处理后看是否还有这个杂带也可明确，或者单抗的交叉会小一些）。
9．关于2D上的5个点。楼主一定至少做3个样本的2D予以验证。Uuuuuuuu提出的突变，也是思路之一。
10．提供几个的非常有价值的免费文献，我上面的分析主要也是参考这些文献（中文文献就不要再搜了，我搜过，没有搜到什么有价值的文章）。请楼主仔细阅读，注意文献中研究方法和结果解释，对本问题的解释及后续的实验设计很有帮助。楼主看完后还望对几位战友的讨论做个总结或提出自己的观点，时间不限，一两个星期以内都可以的，1个月后都可以，只要楼主的课题有所进展，我随时关注。也算是楼主对自己课题的负责。
a
J. Biol. Chem., Jan 1992; 267: 794 - 803.
Human HSP27 is phosphorylated at serines 78 and 82 by heat shock and mitogen-activated kinases that recognize the same amino acid motif as S6 kinase II
b
J. Biol. Chem., Vol. 262, Issue 32, 15359-15369, Nov, 1987
Characterization and purification of the small 28,000-dalton mammalian heat shock protein
c
J. Biol. Chem., Aug 1991; 266: 14721 - 14724.
Identification of the Phosphorylation Sites of the Murine Small Heat Shock Protein hsp25
d
非免费的（摘要免费）
J Cell Physiol, Apr 1991; 147(1): 93-101.
Phosphorylation of HSP27 during development and decay of thermotolerance in Chinese hamster cells.
最后感谢色谱老前辈百忙之中前来助阵，我也觉得western图上不是降解的表现（见我帖链接 cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/6005760') ）。色谱前辈的观点也增强了我对翻译后修饰的认同。
站友的课题正好与此问题类似，分析的也很独到，欢迎常来蛋白版讨论。
楼上说的切胶后做后面的那些实验（我看不明白几个缩写的），与质谱的思路是类似的。
楼上说的glycerol-urea electrophoresis（甘油尿素电泳？），也是解决办法之一。

作者: any333 时间: 2014-2-12 16:56

我彻底迷惑了
lz说“5个HSP27斑点,匹配率为47%/74%/49%/60%/47% ”
楼上说“人HSP27有3个磷酸化位点均为丝氨酸”
到底llz使用得HSP27样本有几个磷酸化位点呢
个人觉得目前最方便得搞清楚问题得方法就是把条带切下来去打个质谱

作者: any333 时间: 2014-2-12 17:06

经过我们内部的讨论，认为400基本分不开
而且不像是糖基化
关于磷酸化在2D上的表现，有三个磷酸化位点的蛋白肯定不会出8个点
同时有2个位点磷酸化的跟有一个位点磷酸化的能不能分的开还是个问题
收回我关于打质谱的建议，
请考虑一下是不是降解

作者: yes4 时间: 2014-2-12 17:06

降解是不太可能的
看楼主的第一句话 "在2DE中发现多个HSP27斑点，且位于同一分子量水平线上"
可见分子量基本相同无法排除细微的差别（尽管存在除非专门用MS测定分子量）
靠楼主到不出现了，估计是怕别人窃取有用信息吧呵呵
我的文章经过我们的申述，编辑貌似又同意接受了，都准备改投其他杂志了

作者: wood533 时间: 2014-2-12 17:07

我觉得可以做一下HPLC/MS/MS，从MS/MS图谱上可计算出是否有氨基酸被修饰。

作者: tuuu2 时间: 2014-2-12 17:07

看一副我前段时间做的一副2DE+WB图吧
图中很多点就是一个蛋白的不同形式PTMs

图片附件: 30646041.jpg (2014-2-12 17:07, 32.75 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=23016

作者: redbutterfly 时间: 2014-2-12 17:08

我是做植物抗逆的。我在目前的试验中发现胁迫处理诱导了两个新蛋白点的出现，这两个新蛋白与原来的2个蛋白位置接近，分子量相同。一级质谱结果检索不出结果，但是这4个蛋白点的PMF数据非常类似。我现在怀疑新出现的蛋白点是原来蛋白的PTM形式，现在在考虑怎么进一步往下做。想听一下朋友们的建议。

作者: 喵咪 时间: 2014-2-12 17:09

各位战友帮忙看看，我的也出现了双带，抗体是 FKHRL1 (Phospho-Ser253) Antibody。这个话题讨论了很多，关于2DE的问题我看不懂（才疏学浅），但我想问，即使投SCI时附注了说明产生双带的原因，但如果其他大部分的文献做出来的是一条带，那杂志是不是不可能接受我的申述呢？thanks!

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