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标题: 【求助】电转化毕赤酵母GS115后PCR验证不对 [打印本页]

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:19 标题: 【求助】电转化毕赤酵母GS115后PCR验证不对

我现在做酵母表达，我所要表达的蛋白来源于酿酒酵母，理论上不应该对毕赤酵母产生毒性，应该可以在GS115中表达。我用ｐPIC9K的质粒，连接上以后测序结果正确，用自己的引物PCR反应后可以得到大小正确的条带，但是诱导后没有表达。后来我用5‘AOX于3’AOX的引物扩增，所得到的条带于表达手册上给的标准不一致，我找不到原因，望前辈指教。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=23025

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:23

如上图，1－5是电转后挑的克隆，９ｋ是空质粒转化后的克隆，marker依次是5bp，3bp，2bp，1bp，750bp，500bp,空质粒倒是可以得到一条正确的条带，但是其他克隆却不对。我的基因片段是900bp。拜请前辈们指教

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:24

对了，我用的Sal I 做的线性化

作者: c86v 时间: 2014-2-13 10:29

如果是那个较亮的主带,应该大小是对的吧,500+900

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:29

谢谢楼上的回复，可为什么还会扩出下面的大约500bp的条带呢，这让我百思不得其解

作者: bamboo16 时间: 2014-2-13 10:29

我也遇到与你同样的问题。不解。

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:30

你有试过重新转化吗？

作者: junjie05 时间: 2014-2-13 10:31

记得一篇综述上提过，酵母诱导的重组有三种形式，其中除了双交换重组外，存在两种插入重组。而插入重组中有一种是插入到了AOX1以外的地方（具体的位点忘记了……）
很可能你的这几个都是这样的情况。这种情况下，使用通用引物进行PCR会同时出现这两条带，但是甲醇诱导却起不到明显效果。
我真正感兴趣的倒是另外的两条1kb和2kb，3号样品尤为明显。这两个是怎么来的，难不成质粒中联入了多个500bp？？还望高手解答～

作者: junjie05 时间: 2014-2-13 10:31

对了，忘记说，这种插入的情况下，MD和MM平板上的长势基本上是没有区别的。

作者: duoduo 时间: 2014-2-13 10:31

可问题是我在MD和MM平板上验证过，有很明显的区别。28度培养两天，在MM平板上基本不张，但在MD上长得很好。我也搞不清楚这是怎么回事

作者: 小游abc 时间: 2014-2-13 10:35

你可以试试一条用5‘AOX1一条是你自己目的基因的特异性引物批一下，这样可以鉴定非定向克隆。这样应该就能比较准确的鉴定出是否将目的基因转进去了。

作者: 阿凡提 时间: 2014-2-13 10:36

你有试过重新转化吗？

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还没呢，我打算挑几个先诱导看看

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:36

你验证后如果有表达的话能否请你告诉我一声，我做个参考，不胜感激。

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:37

多谢指点，我先试试，有结果了再请教你。所以这个贴烦你再关注几天，我有结果就发上来。非常感谢。

作者: 喵咪 时间: 2014-2-13 10:37

记得一篇综述上提过，酵母诱导的重组有三种形式，其中除了双交换重组外，存在两种插入重组。而插入重组中有一种是插入到了AOX1以外的地方（具体的位点忘记了……）
很可能你的这几个都是这样的情况。这种情况下，使用通用引物进行PCR会同时出现这两条带，但是甲醇诱导却起不到明显效果。
我真正感兴趣的倒是另外的两条1kb和2kb，3号样品尤为明显。这两个是怎么来的，难不成质粒中联入了多个500bp？？还望高手解答～

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酵母诱导的三种重组方式：
Bgl 2 for replacement at AOX1
Sac I for insertion at AOX1
Sal I for insertion at His4
我采用的是Sac I 酶切，理论上应该产生AOX1 位点的insertion，不是吗？

作者: 喵咪 时间: 2014-2-13 10:39

我昨天挑了clone于BMGY中培养，明天可以开始诱导，诱导要4，5天，估计要下周出结果。无论如何，我到时会给个结果上来。同时，我打算要把从别处获得的positive control也来尝试进行一次转化表达，考虑用三种酶分别切。

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:39

酵母诱导的三种重组方式：
Bgl 2 for replacement at AOX1
Sac I for insertion at AOX1
Sal I for insertion at His4
我采用的是Sac I 酶切，理论上应该产生AOX1 位点的insertion，不是吗？
理论上是这样的，我用SａｌI 进行线性话，但是结果也是跟理论不符，所以我才纳闷是否是我中途某个实验过程错了，还是这种不符合的情况也是实验范围内允许的。我现在也在重新诱导，差不多也要4到5天后出结果。到时我也把我的结果传上来，大家一起参考吧

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:39

我的结果出来啦，我诱导了四天，因为第四天检测到有杆菌污染，我就没有接着诱导了。
跑交结果很奇怪，基本上就没有条带，对照和样品都一样，只有沉淀里有很多条带，但对照和样品没有很明显的差别。

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:40

1234泳道为上清，5678泳道为沉淀。其中1357是对照。

作者: 喵咪 时间: 2014-2-13 10:40

我的western结果也出来了，是个白板。
我采用3ml OD=5左右的菌诱导表达，72h取100ul培养物离心得约80ul培养基上清，最终上样20ul。
不过，我将膜用立春红染色后，发现上清蛋白量非常非常少，今天考虑收样后浓缩再跑胶western

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:41

你可以试试一条用5‘AOX1一条是你自己目的基因的特异性引物批一下，这样可以鉴定非定向克隆。这样应该就能比较准确的鉴定出是否将目的基因转进去了。

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我扩了，但是扩不出来。我用但向的５‘AOX的引物也扩不出来。这是不是说明没插入啊。可是我自己的引物为什么可以扩得出来呢

作者: 喵咪 时间: 2014-2-13 10:41

QUOTE:

原帖由 shenkunjie 于 2014-2-13 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你可以试试一条用5‘AOX1一条是你自己目的基因的特异性引物批一下，这样可以鉴定非定向克隆。这样应该就能比较准确的鉴定出是否将目的基因转进去了。

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我想请教你是如何将收到的培养基上清用于电泳上样的？

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:42

QUOTE:

原帖由喵咪于 2014-2-13 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想请教你是如何将收到的培养基上清用于电泳上样的？

请教不敢当，我也是问题多多，大家一起讨论讨论。
我一般取2 ml样品，离心后上清用TCA沉淀浓缩，加loading buffer煮过之后，就按一般的方法进行SDS－ｐａｇｅ

作者: xingyi08 时间: 2014-2-13 10:42

结果正确啊，
目的基因插入5‘AOX引物后的区域，
PCR结果就是
目的基因长度+（5'AOX引物处~目的基因插入位点的片段长度）约500bp
即900bp+500bp=1400bp左右

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-13 10:42

QUOTE:

原帖由 xingyi08 于 2014-2-13 10:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

结果正确啊，
目的基因插入5‘AOX引物后的区域，
PCR结果就是
目的基因长度+（5'AOX引物处~目的基因插入位点的片段长度）约500bp
即900bp+500bp=1400bp左右 ...

可是下面好像多一条500bp的条带啊，而且没有操作手册上说的2.2kb的那条带

作者: 17806246032 时间: 2017-11-27 10:59

请问各位的问题解决了吗？我也遇到同样的问题

作者: 19909863828 时间: 2024-3-17 19:57 标题: 转化后如何PCR验证

楼主你好，我有个问题想请教以下，将目的基因转化到毕赤酵母GS115基因之中后，需要用PCR验证是否转化成功，进行PCR时如何设计引物？是个什么样的思路？万分感谢

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