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标题: 【求助】酵母双杂交后期验证求助 [打印本页]

作者: fsdd817 时间: 2014-2-22 16:18 标题: 【求助】酵母双杂交后期验证求助

实验已经做到显色结束了，大概得到了25个可能的阳性克隆，然后就是提质粒转大肠验证了，最近已经做了三次提质粒，用的是蜗牛酶（以前用过，可以提，但是效率比较低），提取的总DNA转化大肠杆菌也可以长，但是挑大肠单克隆摇菌过夜就是无法长起来，然后也做了直接菌落PCR，提取的总DNA也做了PCR，但是都没有结果……会是哪一方面出问题了呢？破壁还是其它的原因，筛选出来的克隆里面有没有可能根本就不含有文库蛋白呢？请园子里面高人指教～！

作者: fei1226com 时间: 2014-2-22 16:19

你筛的什么文库啊？一般筛出来的AD质粒会很大，所以转细菌会比较难。我试过，直接从主平板上挑出单克隆，摇起来立即提质粒（我用的玻璃珠法），效果会比较好。然后转化这一步，最好有电穿空仪就会比较容易做，上次我转60个克隆，鉴定完也差不多用了两个月的时间。

作者: fsdd817 时间: 2014-2-22 16:19

QUOTE:

原帖由 fei1226com 于 2014-2-22 16:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你筛的什么文库啊？一般筛出来的AD质粒会很大，所以转细菌会比较难。我试过，直接从主平板上挑出单克隆，摇起来立即提质粒（我用的玻璃珠法），效果会比较好。然后转化这一步，最好有电穿空仪就会比较容易做，上次我转60个克隆，鉴定完 ...

现在有一点进展，就是换了各种方法（玻璃珠，蜗牛酶，超声裂解）提取酵母质粒，然后做PCR，BD及AD都可以扩出来，说明质粒都在，但是转化大肠杆菌还是什么都不长……，是不是提取过程中把质粒都已经线性化了呢？怎样解决阿？求高手指教～～！

作者: fsdd817 时间: 2014-2-22 16:25

还是自己顶自己的帖子～好容易提出一个质粒来了，还有二十多个啊，还在奋战，我是不是该考虑换感受态还是提质粒的方法了呢？

作者: eric930 时间: 2014-2-22 16:25

建议最好跑个电泳，看看AD质粒的浓度。如果5ul样品可以比较明显的看出来的话，转化问题就不会太大了。但是如果你没有电穿孔仪的话，还是比较困难的。

作者: fsdd817 时间: 2014-2-22 16:25

提质粒的事情终于告一段落，原来是感受态转化效率低，在这里也可以给后来人做个借鉴：如果自己做的感受态一直转不进去就不要转了。我是直接买的takarar感受态，效率非常高，质粒也都提得差不多了。
后续又有问题出现：老板让拿几个提出来的AD先测序，其中一个测序结果出来以后对插入片段进行了blast比对，发现插入的1.5K的片段不能编码蛋白，也就是说可能是内含子吗？文库是买来的，按理说cDNA文库中不应该有非编码蛋白的的序列啊，我对分子生物学不是特别懂，请高手指教～

作者: NBA 时间: 2014-2-22 16:26

还是有可能的，cDNA文库只是酶切再随机连到载体上的，如果没有经过什么筛选的话，里面什么都有可能有的
楼主一直在反馈信息，加一分鼓励，望继续努力，使讨论能够继续深入进行下去，谢谢合作！
欢迎常到蛋白版

作者: one 时间: 2014-2-22 16:27

提质粒的事情终于告一段落，原来是感受态转化效率低，在这里也可以给后来人做个借鉴：如果自己做的感受态一直转不进去就不要转了。我是直接买的takarar感受态，效率非常高，质粒也都提得差不多了。
后续又有问题出现：老板让拿几个提出来的AD先测序，其中一个测序结果出来以后对插入片段进行了blast比对，发现插入的1.5K的片段不能编码蛋白，也就是说可能是内含子吗？文库是买来的，按理说cDNA文库中不应该有非编码蛋白的的序列啊，我对分子生物学不是特别懂，请高手指教～
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可能是mRNA的非编码区域
我也遇到过的

作者: fsdd817 时间: 2014-2-22 16:27

最近实验进度比较慢，好容易才做到体外验证了，用的pcmv表达载体将AD及BD质粒分别构建好，转染COS7细胞系，然后提取蛋白做体外coip，又有新的问题出现，请教有经验的高手：
我的BD蛋白检测用的c－myc标签，AD用的HA-TAG标签，一直做的瞬转，myc抗体做出来的结果很不错，BD蛋白表达也比较稳定，但是HA标签抗体检测的几个阳性克隆都遇到蛋白非特异性条带很多的状况，是不是HA抗体的问题呢？才买的CST的抗体，跑胶出来会有一二十条条带，反而自己的目的条带一点都不明显。请教用过HA抗体的高手指点一下，是抗体出问题了么，哪个牌子的能好用些？

作者: xiaohuili1323 时间: 2015-5-14 14:08 标题: 回复 #1 fsdd817 的帖子

您好，我刚刚开始做酵母双杂，遇到些问题想请教您。。我是用一个bait筛选一个Library，AH109和Y187mating之后涂板。。我本来打算先在二缺+底物筛，再到四缺+底物筛。但是现在涂了二缺的大板子，就很浓，背景一片灰，有的一片蓝，没法挑单克隆啊。。是这个筛选策略有问题还是涂得问题啊？要稀释多少倍涂吗？这可在呢么办啊？望能和您进一步交流，请您赐教。我的qq 799980896,谢谢！

作者: elaine0825 时间: 2016-8-24 11:42 标题: 回复 #10 xiaohuili1323 的帖子

您好，我也遇到了跟您类似的问题，请问您最后是怎么解决的？最后是稀释了多少倍涂的板呢？

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