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标题: 【求助】 6X His标签蛋白的纯化求助 [打印本页]

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:29 标题: 【求助】 6X His标签蛋白的纯化求助

我用杆状病毒表达系统表达出带有6X His标签的蛋白，请问：选用什么公司的蛋白纯化系统好啊？需要选购哪些试剂？焦急等待中ING……

作者: mamamiya 时间: 2014-2-22 17:30

你可以买镍琼脂糖凝胶和镍NTA琼脂糖凝胶５或１０毫升重力流的预装柱即可，需要可以买点咪唑，配缓冲液按说明书做就可以．手工操作．不需要特别的设备．国产或进口的应该都可以．但是一定要有售后服务．

作者: 66小飞侠 时间: 2014-2-22 17:31

昆虫细胞杆状病毒表达一般是在胞内。
除纯化之外，蛋白酶降解也是非常重要的。
建议使用Roche 的蛋白酶抑制剂 cocktail 来保护蛋白，而且粗样品不要放置，第一时间内尽快纯化。
cocktail有两种，因为要上镍柱，所以一定要选择不含EDTA的那种。
好运！

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:33

今天订购了QIAGEN的Ni-NTA Agarose (25ml)，打完折后人民币2362元。以及QIAGEN的Polypropylene Comumns (5ml)，打完折1380元，是不是有点贵啊？
然后又从生工订购了咪唑，10克要263元。
还想买些透析袋，但是不知道哪儿可以买到，哪位战友知道的话，烦请告诉小弟一声啊~！

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:34

QUOTE:

原帖由 66小飞侠 于 2014-2-22 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

昆虫细胞杆状病毒表达一般是在胞内。
除纯化之外，蛋白酶降解也是非常重要的。
建议使用Roche 的蛋白酶抑制剂 cocktail 来保护蛋白，而且粗样品不要放置，第一时间内尽快纯化。
cocktail有两种，因为要上镍柱，所以一定要选 ...

谢谢！我也正担心目的蛋白纯化前后的降解呢，我会试试看的。

作者: huifeng0516 时间: 2014-2-22 17:35

其实可以试一下GE公司的17524701，5×1ml的预装柱，载量40mg/ml。
可以再配一根脱盐柱，置换缓冲液或者脱盐用，效果比透析好多了，用注射器就可以用。
加起来2000块钱左右就可以了。
也有单独5ml的镍琼脂糖凝胶，只要几百元就可以了。货号大概是17526806

作者: moonlight45 时间: 2014-2-22 17:36

大家好，最近也要做纯化这方面的工作，但经费比较紧张，预装柱有太贵了，如果单独买镍琼脂糖凝胶和柱子，然后自己装柱，这个是不是会便宜一点呢？大家有知道哪里能单独买到柱子的么？一般的公司都只卖预装柱，或只卖镍琼脂糖凝胶？
先谢谢大家了！！

作者: moonlight45 时间: 2014-2-22 17:37

还有一个问题，镍琼脂糖凝胶是不是可以重复使用啊？

作者: ero11 时间: 2014-2-22 17:38

镍琼脂糖凝胶能重复使用．我见过客户用最高的是３００次．

作者: gemei0115 时间: 2014-2-22 17:38

大家好，最近也要做纯化这方面的工作，但经费比较紧张，预装柱有太贵了，如果单独买镍琼脂糖凝胶和柱子，然后自己装柱，这个是不是会便宜一点呢？大家有知道哪里能单独买到柱子的么？一般的公司都只卖预装柱，或只卖镍琼脂糖凝胶？
先谢谢大家了！！

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完全可以买填料自己装柱，这样比较便宜，也可以重复使用。
您可以问一下GE

[ 本帖最后由 gemei0115 于 2014-2-22 17:40 编辑 ]

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:43

大家好，最近也要做纯化这方面的工作，但经费比较紧张，预装柱有太贵了，如果单独买镍琼脂糖凝胶和柱子，然后自己装柱，这个是不是会便宜一点呢？大家有知道哪里能单独买到柱子的么？一般的公司都只卖预装柱，或只卖镍琼脂糖凝胶？
先谢谢大家了！！

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我听隔壁实验室的同学说，柱子可以对注射器、针筒什么的加以改造而成，听他的意思好像是说，柱子的要求不是太高的，买好镍琼脂糖凝胶就行，当然我想能买到柱子的话总比改造来的好吧。
我在东胜创新还找到了Novagen也卖填料的，如Ni-NTA His.Bind Resin(树脂)，10ml打折前是1740元，His.Bind resin打折前是10ml 1392元。
具体可以联系东胜创新以及楼上战友所说的GE试试看。

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:44

还有，订购镍螯合树脂一定要提前1个月起订，因为很多公司在国内没有现货，需要从国外进口二来，要3-4周的说，好浪费时间啊。

作者: jkobn 时间: 2014-2-22 17:45

进口的那样也许没现货,因为他们大多要攒够大的单子这样优惠多,所以没现货,对国产的就没这样的问题,其实国产有的也是不错的.无论镍琼脂糖凝胶或镍NTA琼脂糖凝胶不再那么难生产了.所以不想等时间也可以选国内的.

作者: finger 时间: 2014-2-22 17:45

买点填料，自己就能做了，很简单，只是要预防降解，一步纯化很难做到很纯，看你需要了

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:47

NI柱亲和填料对柱子的要求不是很高,用过GE公司的重力柱,操作很方便,推荐!

作者: zranqi_1 时间: 2014-2-22 17:49

买点填料，自己就能做了，很简单，只是要预防降解，一步纯化很难做到很纯，看你需要了

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纯化后脱盐时通过减小收集体积（根据你后续的实验要求），这样可能会得到几管纯的样品，且也能保证比较高的浓度。

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:50

最近做脱盐的时候,发现回收率只有50%,是不是样品在低盐环境下不稳定?求助

作者: 8princess8 时间: 2014-2-22 17:50

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原帖由 mingming0638 于 2014-2-22 17:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近做脱盐的时候,发现回收率只有50%,是不是样品在低盐环境下不稳定?求助

那看你选择什么除盐的方法,透析要留意是不是有沉淀,蛋白通常需要有点离子强度才好溶解,不能都去掉盐.如果是过柱子要留意柱子有时候盐浓度低会有非特异吸附,所以也需要点离子强度.

作者: fei1226com 时间: 2014-2-22 17:51

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原帖由 8princess8 于 2014-2-22 17:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那看你选择什么除盐的方法,透析要留意是不是有沉淀,蛋白通常需要有点离子强度才好溶解,不能都去掉盐.如果是过柱子要留意柱子有时候盐浓度低会有非特异吸附,所以也需要点离子强度. ...

标记的地方我看不懂，样品过脱盐柱时是将目的蛋白和盐分分开了，本来就会低盐的，那么怎样才能“所以也需要点离子强度”呢？

作者: 8princess8 时间: 2014-2-22 17:53

非特异吸附可以加一步预洗
电导仪测一下更好

作者: zhenxin 时间: 2014-2-22 17:53

柱子在华美，透析代在鼎国

作者: H2O 时间: 2014-2-22 17:54

那看你选择什么除盐的方法,透析要留意是不是有沉淀,蛋白通常需要有点离子强度才好溶解,不能都去掉盐.如果是过柱子要留意柱子有时候盐浓度低会有非特异吸附,所以也需要点离子浓度。
我现在也在做纯化，用NI-NTA纯化一个酶蛋白，纯化前有活性，过柱后活性就消失了，经过做对照得知，是因为咪唑浓度过高（250mM），我现在用Sephadex G-25脱盐，平衡缓冲液用PBS可以吗，还有我的蛋白中有4对二硫键，请问用再加点什么吗？

作者: taoshengyijiu 时间: 2014-2-22 17:55

那看你选择什么除盐的方法,透析要留意是不是有沉淀,蛋白通常需要有点离子强度才好溶解,不能都去掉盐.如果是过柱子要留意柱子有时候盐浓度低会有非特异吸附,所以也需要点离子浓度。
我现在也在做纯化，用NI-NTA纯化一个酶蛋白，纯化前有活性，过柱后活性就消失了，经过做对照得知，是因为咪唑浓度过高（250mM），我现在用Sephadex G-25脱盐，平衡缓冲液用PBS可以吗，还有我的蛋白中有4对二硫键，请问用再加点什么吗？
......

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可以先不加，也许是咪唑干扰，纯化完马上除盐试试．

作者: H2O 时间: 2014-2-22 17:55

可以先不加，也许是咪唑干扰，纯化完马上除盐试试．
非常谢谢，我试试。

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:56

“纯化前有活性，过柱后活性就消失了，”
看来纯化还是需要不断摸索条件的，别看步骤就那么几步，但是要保证最大限度的留住目的蛋白，还是需要优化下条件和一定的运气的。
我的NI-NTA琼脂糖明天就要到了，这两天就要开始纯化试验。
我会将心得体会一一及时上报各位战友。
楼上战友提醒了我，
刚刚从鼎国订购了透析袋，长度都是5M的，我买了宽度是36的，但是对于透析袋的作用原理，不是很清楚，万一把目的蛋白都给透析掉了，那真是得不偿失了！！！

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-22 17:56

透析代使用也是有很多学问的，我也是刚看了些之方面的书，如透析代一定要煮好，且洗干净.之后装蛋白不能太多，里边不要有气泡.夹子一定要夹紧.一次用的透析代不要太长，呵呵，都是自已总结来的.虽说只做了三次纯化，准备明天再做一次，我现在蛋白纯化的挺好的，就是有一个问题好象是蛋白变性的问题，所以想用一个月的时间来解决之，看着有这么多站友奋斗在蛋白的一线上，明天一定要开开心心的做实验了.纯化过程中有什么经验一定要及时的上报啊.让大家一起为蛋白而战吧.

作者: shenkunjie 时间: 2014-2-22 17:57

纯化后马上除盐方法能不能先用纯水透析，然后透上一个小时再换到相应的透析液中，这样是不是能快点将高浓度的咪唑去丢的快一些，而且还会保持蛋白的活性

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:57

蛋白变性的问题貌似很常见呀，晕了，
楼主说要用cocktail 来保护蛋白，这一步是否不可缺少呢？？？

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:58

protease inhibtor cocktai不能随便使用，应该根据下游的实验需要决定使用不同的蛋白酶抑制剂。在直接westernblot的时候使用没有什么顾忌，但在后期涉及纯化，酶切或者某些活性检测的时候，cocktail中的某些抑制剂会干扰下游的实验。
:【求助】蛋白质组学中用何种蛋白酶抑制剂较合适？
摘自panmo2006战友对上述求助帖的回答。所以我打算用PMSF来替代cocktail
我昨天做了第一次纯化，洗脱液有杂带，目的条带不清，无法判断有或无。
打算从以下方面改进：
第一，就是添加终浓度为1mM的PMSF（另一种蛋白酶抑制剂），但是查了很多地方，发现要用异丙醇溶解的，对此，我很担心异丙醇的引入会否影响6XHIS-Tagged蛋白的产量？虽然操作手册上写明少量乙醇或甘油等醇类是不影响纯化的，但是难保异丙醇不会啊！！！
第二，由于6X HIS蛋白与Resin有很强的亲和力，宜用较多的上样量，这样只有极少的杂蛋白结合到Resin上，相反，如果用太多的Ni-NTA Resin，加上binding,washing等操作条件不够严谨（stringent）的话，杂蛋白就有机会结合上去，造成污染.
第三，始终在4度下进行操作。
第四，所有的缓冲液要提供足够的离子强度，例如添加较多的NaCl.
第五，咪唑的作用在于和6X HIS蛋白的组氨酸残基竞争镍离子，因此binding buffer、wash buffer以及ELUTE BUFFER中多试几个咪唑的浓度梯度有利于掌握最佳的咪唑浓度。
第六，在wash resin的过程中通过添加0.1-1%的Triton X-100等detergent来洗去杂蛋白。
摸索条件果然辛苦啊：（（（

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 17:59

相关疾病：
头痛
现在碰到了非常头疼的事情。
SDS-PAGE电泳时，纯化好后的蛋白没有经过透析直接上样，结果还没跑完浓缩胶，就见溴酚蓝参差不齐，东倒西歪，另外，浓缩不成一条直线。简直可以用大花脸来形容，图我就不上了，情况就是这样的。
我唯一能确定的是所制的浓缩胶是没有问题的，其他的线索就是：我的蛋白样品中含有PMSF（用乙醇溶解），较多的氯化钠，一定量的2-ME以及NP-40，说到NP-40，我昨晚纯化的时候，发现树脂结块现象，我估计是NP-40捣的鬼。
做了一个通宵的实验，身心俱疲啊！如果是蛋白电泳正常跑完后，发现纯化结果不好，我也就算了，可以重新摸索纯化条件，可现在连蛋白电泳都不能正常去跑，实在让我失落啊。请战友们指点迷津！

作者: wood533 时间: 2014-2-22 18:00

可以先不加，也许是咪唑干扰，纯化完马上除盐试试．
纯化后立刻脱盐，有活性了，非常感谢啊！够毕业了，呵呵！大家加油！

作者: 49888 时间: 2014-2-22 20:37

我his亲和层析后，将各缓冲梯度下的收集液电泳检测蛋白分布，但电泳后什么也没有！不知道是咋回事？？
还有，洗脱时流速是否有严格要求？我的柱子滴的太慢了，我加压了，不知道会不会是这个影响的？

作者: NBA 时间: 2014-2-22 20:38

也许你蛋白浓度过低,可以浓缩或沉淀后再跑电泳,可参考一些电泳实验书的样品处理,流速不是很严格,用处1-2ml/min都可以.

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 20:39

本人用过GE镍凝胶填料和bio-rad的预装柱，就目前实验效果，GE填料效果要更好。

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2014-2-22 20:41

相关疾病：
头痛
现在碰到了非常头疼的事情。
SDS-PAGE电泳时，纯化好后的蛋白没有经过透析直接上样，结果还没跑完浓缩胶，就见溴酚蓝参差不齐，东倒西歪，另外，浓缩不成一条直线。简直可以用大花脸来形容，图我就不上了，情况就是这样的。
我唯一能确定的是所制的浓缩胶是没有问题的，其他的线索就是：我的蛋白样品中含有PMSF（用乙醇溶解），较多的氯化钠，一定量的2-ME以及NP-40，说到NP-40，我昨晚纯化的时候，发现树脂结块现象，我估计是NP-40捣的鬼。
做了一个通宵的实验，身心俱疲啊！如果是蛋白电泳正常跑完后，发现纯化结果不好，我也就算了，可以重新摸索纯化条件，可现在连蛋白电泳都不能正常去跑，实在让我失落啊。请战友们指点迷津！
回答上述问题: 电泳跑不出来,条带发生扭曲,是因为样品中盐浓度过高,建议脱盐后再跑电泳.

作者: jiushikeshui371 时间: 2014-2-22 20:42

我也做his标签蛋白的纯化，新买了invitrogen的Ni-NTA Agarose,但是纯化的结果是条带很杂。然后我看说明书说为了减少非特异性吸附，可以在binding buffer里加咪唑，浓度是10mM，所以我就这样做了，菌液也是用binding buffer+10mM重悬破碎的，洗脱我是用binding buffer（10mM）、wash buffer20mM、40mM、60mM各40ml洗脱，然后SDS-page分析各组分，发现binding buffer（10mM）洗下很多目的蛋白，wash buffer20mM、40mM、60mM有一点，elute buffer就没有了，这是怎么回事啊？

作者: jiushikeshui371 时间: 2014-2-22 20:42

是不该用binding buffer+咪唑重悬菌液吗？还有，我的binding buffer洗脱液中有较多目的蛋白，我可以再用来上柱子吗？

作者: NBA 时间: 2014-2-22 20:42

你的蛋白也许作用力太弱，如果这样，那你可以在binding buffer别加咪唑，洗脱用2，4，6，8，10mM洗看看能不能好点．总之需要根据实际实验条件修正咪唑的浓度就会有好结果的，可以参考说明书，纯化很难一次就有满意的结果的．

作者: yueban-1147 时间: 2014-2-22 20:43

求助：我表达的一个酶蛋白，含有6His 是包涵体，但我用6M盐酸胍变性后，电泳检测啥也没了，但是用脲表性的是可以看到目的蛋白的。
还有，我用的是Ni-NTA树脂，之后我要通过透析复性，大家给点建议，现在能洗脱下目的蛋白的梯度是60mM 和100mM咪唑复性时设置多大的梯度合适呢？复性完成后用啥来平衡呢？

作者: NBA 时间: 2014-2-22 20:43

盐酸胍干扰电泳，需要去掉才能跑电泳。复性没确切的方案，只能自己摸索。

作者: yueban-1147 时间: 2014-2-22 20:54

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原帖由 NBA 于 2014-2-22 20:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

盐酸胍干扰电泳，需要去掉才能跑电泳。复性没确切的方案，只能自己摸索。

那么如何除去盐酸胍呢？透析？有没有快速除去的方法？以便于检测啊

作者: NBA 时间: 2014-2-22 20:54

三氯乙酸沉淀，直接稀释沉淀都可以．

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 20:55

第一张图中，从左边起第四孔道（包括marker），有一很浓的条带，可是比目的条带（基本在46KD处）多了那么几个KD。第三条MARKER是48KD，
左边起第二孔道是我的上样液，第三孔道是结合后的流出液，第四孔道是洗脱液（Elute），第五孔道不用管，是我另外一个与本实验无关的样品。
我们老师说，如果那条很浓的条带与46KD相符合的话，那这个纯化结果就算很成功的了。
我说，要不先做个透析，然后测个酶活？他说，可以的。
我很着急啊，时间很紧迫，特来求教于战友们。下一步该如何做？

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 20:55

左边起第二和三孔道是elute后的流出液，第四孔道是wash后的流出液（如果那条浓条带是目的蛋白的话，那wash的条件很不好啊，洗掉了这么多目的蛋白），第五孔道是结合后的流出液，第六孔道是上样液。

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 20:56

第三张图是我以前在细胞中表达了目的蛋白后，做的western blot的结果，目的蛋白与预期的相符合。
所不同的是，前面两张是在蚕体里面表达蛋白后，加以纯化，然后跑的blot的图，这一张是在细胞里面的表达，没有进行纯化。
疑惑啊，同样的蛋白在同样的载体里面，带着同样的HIS标签，理应大小一致啊。难道是由于纯化带进了咪唑等杂质，导致marker和样品跑的不一样快？然后marker失去了它的指示大小的作用？？还请朋友们指点一二。。多谢了。。

作者: taoshengyijiu 时间: 2014-2-22 20:56

看了你的贴子觉得很有意思。可以互相学习。按理说（我自己的实验中证实）镍柱纯化过程对目的蛋白在电泳上的影响不会这么明显。对于前两张图中纯化产物是否为目的蛋白的怀疑其实完全可以用Western去检测一下啊，电泳条带与预期条带大小不符是很常见的事情，与很多因素有关。但是如果Western证实是你的条带，那么是否可以不再怀疑了。纯化前的您做了一张Western，那么这张图在电泳时和前两张图的电泳条件是否完全一致啊，上样量肯定应该不同了吧，前两张图有没有加一点还原剂啊？另外还有一点建议，跑电泳时将胶分成两部分，一部分割下来染色作SDS-PAGE，另外一部分上了同样的样品去转膜，这样也有一个比较，否则出现问题也很难分析了。一点拙见，仅供参考。

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 20:57

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原帖由 taoshengyijiu 于 2014-2-22 20:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
看了你的贴子觉得很有意思。可以互相学习。按理说（我自己的实验中证实）镍柱纯化过程对目的蛋白在电泳上的影响不会这么明显。对于前两张图中纯化产物是否为目的蛋白的怀疑其实完全可以用Western去检测一下啊，电泳条带与 ...

谢谢战友的意见！！我今天发的这三张图全是Western的图，而不是蛋白电泳图！关键是Western做出来的条带和预期大小有出入啊。不然我可以斩钉截铁的说，这就是我的目的条带！目前我很是怀疑哪里出了问题。
另外，SDS-PAGE蛋白电泳的条件基本是一致的。当然肯定不会完全一样，比如说你提到的上样量啊（但我最多也只是加了10微升），还有浓缩胶的长度，有时长，有时短，但都维持在1厘米到2厘米之间。因为在蛋白电泳过程中有一个现象，纯化过程中各个阶段的样品好像永远不能压缩成一条细线，我估计应该和盐浓度以及咪唑浓度有关吧？一开始情况还要糟糕，似乎完全不能压缩，经过稍微加长浓缩胶长度以及配制新鲜电泳缓冲液，情况有所好转，但还是有个2-3毫米那么粗，跑出浓缩胶后，顶在最前面的不是溴酚蓝，而是红色的不知道什么指示剂，它与溴酚蓝之间大概有个1厘米稍微不到一点的距离。
你指的还原剂是什么物质呢？
“另外还有一点建议，跑电泳时将胶分成两部分，一部分割下来染色作SDS-PAGE，另外一部分上了同样的样品去转膜，这样也有一个比较，否则出现问题也很难分析了。”
这个我会尝试一下！谢谢

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 20:57

现在碰到了非常头疼的事情。
SDS-PAGE电泳时，纯化好后的蛋白没有经过透析直接上样，结果还没跑完浓缩胶，就见溴酚蓝参差不齐，东倒西歪，另外，浓缩不成一条直线。简直可以用大花脸来形容，图我就不上了，情况就是这样的。
我唯一能确定的是所制的浓缩胶是没有问题的，其他的线索就是：我的蛋白样品中含有PMSF（用乙醇溶解），较多的氯化钠，一定量的2-ME以及NP-40，说到NP-40，我昨晚纯化的时候，发现树脂结块现象，我估计是NP-40捣的鬼。
做了一个通宵的实验，身心俱疲啊！如果是蛋白电泳正常跑完后，发现纯化结果不好，我也就算了，可以重新摸索纯化条件，可现在连蛋白电泳都不能正常去跑，实在让我失落啊。请战友们指点迷津！
回答上述问题: 电泳跑不出来,条带发生扭曲,是因为样品中盐浓度过高,建议脱盐后再跑电泳.
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我已经停止使用PMSF和NP-40了，另外氯化钠浓度不变，2-ME浓度适当减少。具体细节可参见上楼。“建议脱盐后再跑电泳.”想了想，还得买脱盐柱，所以就没实施战友的建议~：）））
问了其他一些实验室的人，他们说咪唑对蛋白电泳的影响应该不大，不然就不会透析前就去跑蛋白电泳了。

作者: taoshengyijiu 时间: 2014-2-22 20:58

前面的帖子没有仔细看，只是从你的图看起了，发现你用了2-ME，也就是我说的还原剂，加了还原剂后蛋白条带在电泳时泳动速度会变慢，就向你在图一和图二中的那样，当然如果还原不彻底，就是加的还原剂剂量不够的话，可能图二和图三中的条带都会出现，彻底不加还原剂，理论上应该是图三的条带。个人见解，仅供参考。

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 20:58

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原帖由 taoshengyijiu 于 2014-2-22 20:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

前面的帖子没有仔细看，只是从你的图看起了，发现你用了2-ME，也就是我说的还原剂，加了还原剂后蛋白条带在电泳时泳动速度会变慢，就向你在图一和图二中的那样，当然如果还原不彻底，就是加的还原剂剂量不够的话，可能图二和图三中 ...

图三的确是彻底没加还原剂！！
“加了还原剂后蛋白条带在电泳时泳动速度会变慢”？？难道真的是这个原因导致图一和二的特异性条带看起来跑得比图三的要慢？？

作者: taoshengyijiu 时间: 2014-2-22 21:39

将加还原剂和不加还原剂的同时用纯化前和纯化后的样品跑下电泳，不用做Western，多上点样，跑个PAGE胶就看出来了，试试吧

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 21:39

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原帖由 taoshengyijiu 于 2014-2-22 21:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

将加还原剂和不加还原剂的同时用纯化前和纯化后的样品跑下电泳，不用做Western，多上点样，跑个PAGE胶就看出来了，试试吧

不加还原剂的，即在细胞内表达的蛋白，我没有进行纯化。
加还原剂的，即在蚕体内表达的蛋白，我以前用纯化前和纯化后的样品跑过SDS-PAGE.请看下图，从左边起第一孔道至第四孔道均为洗脱液（最终的纯化后样品），第五孔道为WASH后的流出液，第六孔道为结合后的流出液，第七孔道为结合前的上样液，即所谓的纯化前的样品吧。从图似乎看不出什么结果来。
其实2-ME的作用只是为了防止蚕体血液变黑，加2-ME是不得已而为之。

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 21:40

今天又做了一遍western，SDS-PAGE所用的溶液除了30%聚丙烯酰胺以及APS外，我都用上了新鲜配制的。发现电泳跑完的时间有所缩短，这是好事，：））
但是western结果还是如出一辙，有很浓的条带，但是比48KD要大，而本人预期的结果在46KD。
我打算近期做个脱盐，时间紧迫，越快越好。脱盐后测下酶活，如果有酶活，那就得了，证明纯化结果还是马马虎虎的，老板那边至少可以有个交代。
脱盐和透析之间，我最终选择了脱盐，用隔壁实验室同学的脱盐设备。

作者: mingming0638 时间: 2014-2-22 21:41

目前进展：
脱盐后测出样品有纤维素酶活，脱盐后的样品SDS-PAGE分析无条带，这是因为脱盐后纯度提高了，浓度下降了。Western Blot分析有条带，条带大小还是比48KD来的大。重复了3，4次都是同样的结果，看来不用在做了。只是没法说清楚为什么细胞内表达和家蚕体内表达出来的蛋白质大小不一样。很郁闷。哪位战友可以帮我点播一下！万分感激。不然没法毕业了。。。

作者: daod 时间: 2014-2-22 21:41

各位：
我现在也一直在做纯化，目的蛋白带6-His，可是纯化的结果不怎么纯，我的bing buffer中咪唑的含量是20 mM，elution buffer中咪唑含量是500 mM，作过梯度洗脱，50mM、100mM、200mM，只有在100mM和200mM洗脱是出现蛋白吸收峰，很少，500 mM比较多，但是这样操作能减少杂带，但是最后蛋白还不是特别纯，有什么办法让蛋白更纯吗？
自己装的柱子，填料是国产的。

作者: wls*^* 时间: 2021-12-24 22:05 标题: 回复 #55 daod 的帖子

你好，我现在遇到了同样的问题，bing buffer用的是TBS buffer，washing buffer用的是TBS buffer +10 mM咪唑，elution buffer是TBS buffer +250 mM咪唑，之前提取过一次，那次挺纯的，之后再用一样的方法elution buffer条带很杂，想请教一下您

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作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-17 16:23

对于选择蛋白纯化系统和试剂，以下是一些常见的供应商和试剂，你可以根据实验室需求和实验设计进行选择：

蛋白纯化系统供应商：

GE Healthcare: 提供多种蛋白纯化系统，如ÄKTA系列蛋白纯化工作站。
Bio-Rad: 提供NGC Chromatography系统和相应的色谱柱，适用于多种蛋白纯化方法。
Thermo Fisher Scientific: 提供丰富的蛋白纯化试剂盒和系统，如Pierce蛋白纯化系列产品。
重组蛋白纯化试剂：

His标签结合树脂：常用的有Ni-NTA树脂（如Qiagen的Ni-NTA Agarose）、TALON树脂等，用于His标签蛋白的亲和纯化。
洗脱缓冲液：常用的洗脱缓冲液包括含有高浓度Imidazole或EDTA的缓冲液，用于从柱子上洗脱目标蛋白。
蛋白质定量试剂：如BCA蛋白定量试剂盒（如Thermo Fisher Scientific的Pierce BCA Protein Assay Kit）用于测定蛋白样品的浓度。
在购买之前，建议你在实验室内部或与同行交流，了解他们对不同供应商和试剂的使用经验和意见，以确定最适合你实验需求的选项。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-8 15:07

对于6X His标签蛋白的纯化，你可以考虑使用亲和层析技术，其中Ni-NTA（镍螯合树脂）是常见的选择，因为镍螯合树脂能够特异地与6X His标签结合。以下是一些建议的公司和试剂，以及相关的步骤：

公司推荐：

1. Qiagen: Qiagen提供了许多用于His标签蛋白纯化的试剂盒，例如QIAexpress Ni-NTA蛋白纯化试剂盒。

2. Thermo Fisher Scientific: Thermo Fisher提供Pierce His蛋白纯化产品线，包括列洗蛋白纯化试剂盒等。

3. GE Healthcare: GE Healthcare提供Ni Sepharose等蛋白纯化产品，适用于His标签蛋白纯化。

试剂选择：

1. Ni-NTA树脂：选择高质量的Ni-NTA树脂，以确保良好的亲和层析效果。

2. 洗脱缓冲液：通常使用含有梯度浓度的缓冲液来洗脱His标签蛋白。例如，含有250 mM imidazole的缓冲液通常用于洗脱。

3. 洗脱缓冲液的稀释液：用于将高浓度洗脱缓冲液稀释至适当浓度，以避免直接暴露蛋白于高浓度洗脱缓冲液。

4. 质量控制试剂：质量控制步骤是确保纯化蛋白质质量的关键。你可能需要BCA或Bradford蛋白定量试剂来确定蛋白浓度。

步骤概述：

1. 表达和收获：使用杆状病毒表达系统表达目标蛋白，确保表达充分。

2. 裂解和提取：裂解细胞并提取蛋白质。使用含有6X His标签蛋白的提取缓冲液。

3. Ni-NTA亲和层析：将提取的蛋白质样品与Ni-NTA树脂混合，充分搅拌，以允许His标签蛋白与树脂结合。

4. 洗脱：使用梯度浓度的洗脱缓冲液洗脱非特异性结合的蛋白质。

5. 纯化评估：分析洗脱样品，可以使用SDS-PAGE或Western blot等方法。

6. 浓缩和稀释：浓缩纯化蛋白质，然后稀释到适当浓度。

7. 存储：将纯化蛋白质分装并存储在适当的条件下。

请注意，每个公司的试剂盒和流程可能会有细微的差异，所以在使用之前务必阅读和遵循所提供的具体操作手册。同时，确保在实验过程中采取适当的生物安全和实验室操作规范。如果你对实验步骤不确定，最好在实验前与实验室同事或导师讨论，以确保获得准确的指导。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-18 16:24

选择蛋白纯化系统时，可以考虑以下一些知名的商家和产品：

1. GE Healthcare: GE的Ni Sepharose系列是常用的蛋白纯化树脂，用于His标签蛋白的亲和层析。你可以选择不同规格的柱子和试剂盒，比如HisTrap FF柱和ÄKTA系统。

2. Thermo Fisher Scientific: Thermo Fisher的Pierce His-Tag Purification Kits提供了一套完整的蛋白纯化解决方案，包括树脂、缓冲液和附加的试剂。

3. Qiagen: Qiagen的Ni-NTA纯化系统也是常用的选项，包括不同尺寸的柱子和纯化试剂盒。

4. Bio-Rad Laboratories: Bio-Rad提供了一系列的蛋白纯化树脂和设备，适用于His标签蛋白的纯化。

选购试剂时，通常需要以下几种基本试剂和设备：

亲和层析树脂：例如Ni-NTA或Ni Sepharose等。
缓冲液：用于样品的洗脱和洗脱His标签蛋白的缓冲液。
细胞裂解液制备试剂：包括细胞破碎缓冲液、蛋白酶抑制剂等。
洗脱试剂：通常是一些含有不同浓度Imidazole的缓冲液。
分析试剂：用于蛋白质的浓度测定、SDS-PAGE凝胶、Western blot等。
此外，如果你没有经验进行蛋白纯化，建议在开始之前仔细阅读相关的操作手册和文献，或者咨询在这方面有经验的同事或导师，以确保你能够成功地进行蛋白纯化。纯化步骤可能会因样品和实验条件的不同而有所不同，所以一定要根据具体情况进行优化。

作者: 15623267008 时间: 2023-9-23 19:24

求助各位大佬，我用镍珠纯化蛋白时即使用高浓度的咪唑也洗不下来蛋白是因为什么啊？之前的时候是可以洗脱下来的，但是这两次就不行了。

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