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标题: 【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题 [打印本页]

作者: yjf1026 时间: 2014-3-10 17:49 标题: 【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题

我因为做western blot 总是没结果，就严格按照cell signa的说明书进行操作，将多抗用5%的BSA稀释成10ml后4度冰箱孵育过夜，但是依然无结果。我将稀释后的抗体准备重复使用，但是原来未稀释前在-20度时抗体不结冰，现在稀释后则结冰，这样用时反复冻融会不会影响结果。还是抗体在稀释后应放4度保存？
另外我想问一下这样的抗体一般可用几次。
如果是在室温下孵育的抗体可不可以重复用，上次我用此抗体，连原来做出来的都未出结果。

作者: DONT 时间: 2014-3-10 17:49

抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

作者: yes4 时间: 2014-3-10 17:50

抗体可重复使用3次一般没有问题，可以-20储存，且夏天最好放-20储存，这样可以保存时间长一点。

作者: bamboo16 时间: 2014-3-10 17:50

本人建议：
稀释的抗体可以在4度下放1个月左右，不会影响抗体的效果，前提是加入0.2％的NaN3防腐，绝对可行，本人曾经用一个磷酸化抗体也是CS公司的p-erk用了2个月，到后来是牛奶都很淡了，照样信号很强的

作者: yonger 时间: 2014-3-10 17:50

本人曾经用一个磷酸化抗体也是CS公司的p-erk用了2个月，到后来是牛奶都很淡了，照样信号很强的

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我个人认为是不是即使牛奶很淡了，目的蛋白含量仍然很高，所以不影响结果呢？牛奶里的beta-Casein, alpha-Casein 等都是高磷酸化的蛋白，而且在牛奶里含量都很高。

作者: moonlight45 时间: 2014-3-10 17:51

你好：我很理解你的心情，因为我也出现过这种情况，我这几个月光做western blot 了，我在这里谈谈经验,希望对你有帮助，你近期的一个帖子我也回答了，你注意查看一下：
1。做western blot 时转膜是一个分水岭，用丽春红染色后（5‘）看条带有无或是否清晰，你所说的没结果到底是怎么个没结果。如果膜上没有条带或条带不清晰，那肯定是蛋白制样和转膜的问题。如果条带清晰而没有结果，就应该依次排除一抗，二抗，和ECL的问题，你抽几微升二抗点在一个新的小NC膜上，等二抗干了以后，连同要杂交的NC膜同时曝光显影，如果小膜上有黑点，而你要杂的蛋白没有条带，那肯定是一抗有问题，如果小膜上没有黑点，那二抗和ECL两者有一个有问题或都有问题。你也可以设计其它方法检测你的实验试剂和步骤是否没有错误。
2。封闭液最好用脱脂奶粉配，一抗用5％BSA加0。02％的叠氮钠在4度至少可以保存一个月，禁止反复冻融，二抗也用脱脂奶粉配，4度可以保存一个星期。
3。具体实验方法参见分子克隆第二版。

作者: is2011 时间: 2014-3-10 17:51

看到有这么多的人回应，真是太感动了，最近在放假期间，实验室的人特别少，我每天做实验感觉都与世隔绝了。我现在是用立春红染色，可见不清晰的条带，但是暴光后，底片上什么都没有。另外我想问的是用BSA稀释的抗体加入叠氮钠后是否会影响抗原与抗体的反应，且问一下，10ml的抗体可用几次？并且问一下Western的结果如何分析，难道一定要做内参照吗？

作者: yonger 时间: 2014-3-10 17:52

帮您查了一下，到处也没有找到叠氮钠防腐的机理。
叠氮钠是“弱氧化剂”，因为两个N 之间的三键，导致该化合物有夺电子的能力。而电子是一些细菌病毒复制再生所必须的。查了一下PUBMED，只有叠氮钠影响酶功能的文章，没有说到影响抗原抗体结合。

作者: 8princess8 时间: 2014-3-10 17:52

如果担心叠氮钠对后面的影响，可以考虑过滤除菌。优点是不用担心叠氮钠的影响，缺点是保存的过程中也要注意无菌。
另外，如果样品中目的蛋白含量很低，转移后用丽春红并不一定能染出条带，特别是真核表达的产物，一般表达量不高，蛋白量少。我有几次真核表达产物转印后，丽春红染未见条带，接着做下去，结果仍然出来了。

作者: ha111 时间: 2014-3-10 17:52

抗体我用western blot C液稀释后，使用大概有5～6次，每次用完回收放于4度保存。最近再用只是显色浅，还能用。

作者: orangecake 时间: 2014-3-10 17:53

我WESTERN时：
转膜用36V，18MA,20小时。
marker可以转上。
丽春红染色，膜上没有明显的条带，可见蛋白泳道影，向刷子刷得一样。
靠马斯亮蓝染胶，胶上仍可见蛋白条带。
不知问题处在那里？
谢谢！

作者: 33号 时间: 2014-3-10 17:53

0次都没关系,加NaN3,放-20度一年没问题,我这么说,试剂公司可要骂我了,没骗你!!

作者: greenbee 时间: 2014-3-10 17:53

不知你用的是哪种仪器转膜，
电压和电流是不是太小了？转膜时间太长了。
我们用Bio-Rad公司的转膜仪，如果按稳压条件，
是100V，2小时。

作者: zsxan1990 时间: 2014-3-10 17:54

如果你的二抗连的是POD，叠氮钠会影响其灵敏度，所以这种情况下不要加

作者: wmp1234 时间: 2014-3-10 17:54

我用的是Bio-rad公司的转膜仪，350mA，一小时，至今没有失败过
关于抗体，最好不要重复使用

作者: bs4665 时间: 2014-3-10 17:54

我的一点意见：
1. 一抗价格很贵的话，可以考虑反复用的。孵育液中，－20反复冻融3－4次做绝对没有明显信号减弱的情况。我在美国的师兄说他们是milk & 叠氮钠 & 4度，用一个月，绝对没问题。
2. 还有一个方法，不知道你们是怎么孵育的？我一抗一般用量很少。10 lanes的膜也只用到2ml孵育液，可以用封口膜，剪一块，对摺，把膜放里面，加上一抗孵育液，然后放在室温或4度，不用shaking的，我们实验室一直这么做，效果很好，很节约。
3. 二抗便宜，我一般就用一次，也用培养皿 & 足够量的孵育液，shaking了。

作者: am10 时间: 2014-3-10 17:55

我的一抗用了3到4次后目的条带就开始弱了。
做DAB显色还可以
如果是做ECL，目的条带就明显减弱了。很奇怪哦

作者: bs4665 时间: 2014-3-10 17:55

QUOTE:

原帖由 am10 于 2014-3-10 17:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的一抗用了3到4次后目的条带就开始弱了。
做DAB显色还可以
如果是做ECL，目的条带就明显减弱了。很奇怪哦

1. 是的，如果－20度反复冻融的话，4次以后我就不用它做ECL显色的western了。
2. 还有就是抗体本身质量好坏的差异也会造成信号减弱的。我比较过，我买的进口的一抗、国内分装的一抗或自己做的抗体，可以反复使用的次数都不一样。因此，你对自己常用的一抗可以先摸一下条件，看看在相同的其他条件下（上样量、转膜状态、等等）会出现什么情况，以后就可以按照这个条件进行实验了。
3. 所以不是很奇怪的，呵呵。

作者: orangecake 时间: 2014-3-10 17:55

我的一抗用含脱脂奶粉的TBST稀释，能否加叠氮钠？如果可以，加多少？我看上面的帖子有的说0.2％，有的说0.02％。望诸位高手快快告知，明天就要稀释宝贵的一抗了。THANKS.

作者: nn255 时间: 2014-3-10 17:56

可以，0.02％

作者: PINK 时间: 2014-3-10 17:56

没有稀释的时候抗体在-20℃下不结冰应该是加了甘油，甘油通常能有效地增强蛋白质的稳定性，并且使蛋白质能在-20℃不结冰状态下保存。我现在用的博士德的抗体产品中含有30%的甘油，你看看你购买的抗体产品的说明书就知道了。
防污染可添加0.02%的叠氮钠，或0.01%的硫柳汞。叠氮钠能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此不能用于活体实验；因为含有氨基而能干扰许多标记方法（不过在我的实验里有一步是会受氨基影响的，但在这一步中我做了对照，发现叠氮钠并没有对我的实验产生什么不良影响）；不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体。而硫柳汞不含氨基，不影响基质的稳定性。
容器壁对蛋白质的非特异性吸附可以造成蛋白质变性，因此在稀释的抗体溶液中加入BSA是很有必要的。

作者: bluelake 时间: 2014-3-10 20:22

我的一抗用含脱脂奶粉的TBST稀释，能否加叠氮钠？如果可以，加多少？我看上面的帖子有的说0.2％，有的说0.02％。望诸位高手快快告知，明天就要稀释宝贵的一抗了。THANKS.

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我的经验是0.02%就可以。
在做色谱时的流动相防腐时一般用0.02%（见2005年版药典三部附录）
放射免疫分析法中的缓冲液是适合抗体和抗原结合的，《实用免疫细胞与核酸》中给出的浓度是0.1%。
说明在免疫学实验对它的浓度要求不是很严格的。只要能起到防腐效果又不干扰抗体和抗原反应就可以的。
以上回答不知对你有帮助否？

作者: eric930 时间: 2014-3-10 20:25

我已经按照各位的指导按0.02％的浓度加入了叠氮钠。谢谢大家。

作者: bluelake 时间: 2014-3-10 20:25

叠氮钠不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体吗？那我加什么呢？明天就要用了，大家给我赶紧解答一下。

作者: jingling845 时间: 2014-3-10 20:26

叠氮钠不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体，那你可以加0.01%的硫柳汞。

作者: PINK 时间: 2014-3-10 20:26

谢谢您的解答.我还想问一下,用去离子水还是用TBS配制?谢谢.

作者: 我佛慈悲 时间: 2014-3-10 20:27

请问５％的ＢＳＡ用什么配啊，是ＰＢＳ还是水啊
另外抗ＧＳＴ的一抗，哪儿卖的又便宜，又好用啊，谢谢

作者: 我佛慈悲 时间: 2014-3-10 20:28

＂封闭液最好用脱脂奶粉配＂脱脂奶粉是固体啊，怎么用啊，加多少啊，请各位指教

作者: vvmmoy 时间: 2014-3-10 20:28

封闭液最好用脱脂奶粉配＂脱脂奶粉是固体啊，一般是5%的.融入TBA-tween 20的液体中就可以的.但是一定要现用现配.
有关抗体的反复应用的问题,一定要记住:每个抗体的储存条件不同影响了反复应用的次数.
有的抗体可以用-20度反复应用3-4次.
但是有的抗体则不能,还有的抗体都可以在-80度贮存的条件下反复用几次.
对于应用0.2％的NaN3,也是这个道理!你可以search一下抗体公司的网站,一般都有技术支持的,可以看看!!!

作者: xueyouzhang 时间: 2014-3-10 20:28

不知有没有重复利用二抗的?我的二抗重复用了一次,结果没出结果!是不是二抗不能重复利用啊?

作者: 莲花白 时间: 2014-3-10 20:29

请问５％的ＢＳＡ用什么配啊，是ＰＢＳ还是水啊
另外抗ＧＳＴ的一抗，哪儿卖的又便宜，又好用啊，谢谢

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一般用PBS配，目的是保持一定的缓冲体系。
至于便宜又好用，你说的便宜是指多少钱算便宜?hehe，不介意就联系一下我吧。

作者: birdfish 时间: 2014-3-10 20:29

我近乎于0V，每cm2为0.8mA，转1.5小时就完全了。

作者: 小螺号 时间: 2014-3-10 20:30

我转膜都是100v,1hr.80kd以下都应没问题。电压太高，功率太大都不好。如果放在4度冷室或冰箱中转效果会更好，但时间要延长0.5-1小时
还有，我的一抗也是用封闭液配的，4度放一周就成白色悬液了

作者: ha111 时间: 2014-3-10 20:30

叠氮钠不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体吗？
是这样吗？

作者: wu11998866 时间: 2014-3-10 20:31

楼上有人指出NaN3不能用于HRP的检测方法，请问是说不能用NaN3配置一抗，还是一抗二抗都不能配置了？
"叠氮钠能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此不能用于活体实验；因为含有氨基而能干扰许多标记方法（不过在我的实验里有一步是会受氨基影响的，但在这一步中我做了对照，发现叠氮钠并没有对我的实验产生什么不良影响）；不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体。"
谢谢

作者: bluelake 时间: 2014-3-10 20:32

可以配备一抗,不能配HRP标志的二抗

作者: tudou85 时间: 2014-3-10 20:32

没有稀释的时候抗体在-20℃下不结冰应该是加了甘油，甘油通常能有效地增强蛋白质的稳定性，并且使蛋白质能在-20℃不结冰状态下保存。我现在用的博士德的抗体产品中含有30%的甘油，你看看你购买的抗体产品的说明书就知道了。
防污染可添加0.02%的叠氮钠，或0.01%的硫柳汞。叠氮钠能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此不能用于活体实验；因为含有氨基而能干扰许多标记方法（不过在我的实验里有一步是会受氨基影响的，但在这一步中我做了对照，发现叠氮钠并没有对我的实验产生什么不良影响）；不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体。而硫柳汞不含氨基，不影响基质的稳定性。
容器壁对蛋白质的非特异性吸附可以造成蛋白质变性，因此在稀释的抗体溶液中加入BSA是很有必要的。
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加了甘油不会结冰吗？

作者: eric930 时间: 2014-3-10 20:33

可见western生命力之顽强。实验室有钱的话，抗体只用一次。我所在的实验室是整张膜加5ml稀释后抗体。

作者: gogo 时间: 2014-3-10 20:33

看来大家对关于一抗和二抗的重复使用问题都是很关心的啊！有空去看看我以前的帖子讨论的：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=9030865&sty=1')，
只是不知道为什么那个帖子已经不能回复了，请问版主难道回复还有时间限制的吗？

作者: +小生怕怕+ 时间: 2014-3-10 20:34

我因为做western blot 总是没结果，就严格按照cell signa的说明书进行操作，将多抗用5%的BSA稀释成10ml后4度冰箱孵育过夜，但是依然无结果。我将稀释后的抗体准备重复使用，但是原来未稀释前在-20度时抗体不结冰，现在稀释后则结冰，这样用时反复冻融会不会影响结果。还是抗体在稀释后应放4度保存？
另外我想问一下这样的抗体一般可用几次。
如果是在室温下孵育的抗体可不可以重复用，上次我用此抗体，连原来做出来的都未出结果。
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抗体稀释前是溶解在甘油当中储存，所以-20度并不会结冰。现在你把抗体稀释后使用，有了水在里面，自然会结冰了。一般说来，抗体可以重复使用几次，但这个次数因人，因抗体，因具体实验而异。如果稀释后的抗体在近期会再使用，那建议4度保存，几天后再次使用。并且反复次数不要超过三次为好。如果隔一段时间再用，那么-20度保存，再次使用后，最好不要再冻回去了，抓紧时间再做两次实验好了。
祝好运！

作者: hot_hot_hot 时间: 2014-3-10 20:34

二抗非常便宜，没必要重复使用。

作者: zhezhe 时间: 2014-3-10 20:34

【1】的确有的一抗可以反复应用很多次的，有的用几次就不好用了。主要跟抗体的特性、质量等有关，跟储存等情况也有关。所以，一种一抗稀释液用多长时间，一般只有用了才知道。
【2】当然用一次也可以的，我就是用一次。每次的用量是400微升～1毫升。效果也是很好的。我就是用塑料袋做成小袋子，然后把膜放到里面，然后把一抗稀释液放到里面。然后用封膜机把口封上。这样一抗稀释液就可以把膜全包上了。
【3】二抗也可以这样用，也是很省的，不用重复应用的。

作者: junhun 时间: 2014-3-10 20:35

请问：我所用的封闭液中有NaN3，加一抗、二抗时没有，对结果不会有影响吧？
封闭后反复洗过。

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2014-3-10 20:35

请问：曝光出来的条带效果不好，从条带上可以判断是信号弱还是转膜没转好吗？谢谢！

作者: mamamiya 时间: 2014-3-10 20:36

可以做个考染

作者: ii077345 时间: 2014-3-10 20:36

QUOTE:

原帖由 mamamiya 于 2014-3-10 20:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可以做个考染

请问怎么做？

作者: ii077345 时间: 2014-3-10 20:37

大家好：我做wb时，目的蛋白分子量在38-45之间，SDS-PAGE :120v（恒压）;转膜：我是用湿转：120v（恒压），1.5h。你们觉得这个条件怎样？谢谢！

作者: koook5695 时间: 2014-3-10 20:37

配一抗应该没问题，因为本来就需要彻底洗干净未结合的一抗。
二抗才含有HRP，不能加叠氮纳

作者: 喵咪 时间: 2014-3-10 20:37

买来的一抗里添加有叠氮钠。
我们用的二抗是辣根过氧化物酶标记的，有结果，建议一抗后要洗的干净，没什么大影响。
我们用的是买来的一抗稀释液。
重复利用嘛···会重复利用很多回···在4度保存，一直没出过什么问题（当然也可能出了问题，我们没发现）。
二抗用封闭剂稀释。
封闭剂是5%脱脂奶粉，用TBST溶解。

作者: 喵咪 时间: 2014-3-10 20:38

大家好：我做wb时，目的蛋白分子量在38-45之间，SDS-PAGE :120v（恒压）;转膜：我是用湿转：120v（恒压），1.5h。你们觉得这个条件怎样？谢谢！
120v 1.5h 应该会转过，你可以用两张膜。
转移不可能做到100%都转到膜上，用两张膜转，转完后用立春红染膜，看有没有转过，转过多少···也可以用考马斯染胶，看有多少残留。根据结果再做调整。

作者: wu11998866 时间: 2014-3-10 20:38

我们实验室都是用TBST配成5%的牛奶,再用牛奶配一抗或二抗的,加点叠氮钠可以4度放一个月没问题的

作者: xueyouzhang 时间: 2014-3-10 20:40

请问，是不是封闭和洗膜的结果有很大影响呢？
我做了几个月的WB了，结果总是不稳定，时有时无，虽然有条带，但是却没有趋势。而且背景很深，刚刚换了单抗。听有经验的师兄师姐说，封闭过长会封闭掉目的蛋白，洗膜过短，背景深，洗膜过长的话就会把抗体也洗掉。真的会这样嘛？
还有洗膜TBST里tween20的浓度一般是多少啊？
谢谢各位！
做了很久了，一直没有想要的结果，很着急，现在有点走火入魔了，呵呵！怀疑每一个细节了。

作者: yes4 时间: 2014-3-10 20:40

二抗不能重复利用，即便抗体部分不降解，HRP也会很快降解。二抗甚至不能4度过夜孵育。

作者: dreaming 时间: 2014-3-10 20:42

我都是用一张塑料膜铺在玻璃板上，再放上膜，膜上加稀释的一抗，这样很省抗体，一次大概800微升的稀释液就可以了。所以一直也没有回收过一抗

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