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标题: 【求助】做WB时候怎样才能节省一抗与二抗，又不影响结果？ [打印本页]

作者: sr9971 时间: 2014-3-16 23:22 标题: 【求助】做WB时候怎样才能节省一抗与二抗，又不影响结果？

最近一直在做单抗的WB，先用了小平皿，每个样品需要4~5ML，后来觉得浪费，用5ML的小试管，每个只要2ML，可是却做不出结果来。
请教大家都是怎样做的呢？

作者: txwuyan 时间: 2014-3-16 23:22

用一次性手套然后用封口机封成适合的大小如果只有几个泳道估计3毫升就可以了

作者: wu11998866 时间: 2014-3-16 23:23

我的经历是，是否节省抗体，不是看你使用的抗体稀释液的多少，而是你实际使用的抗体的绝对量的多少。你说用的是4 ml，请问稀释比例是多少。4 ml按照1：2000就是要用2ul抗体液，但是，你用2 ml按照1：500就要用4 ul抗体液，你说2 ml就节约？肯定不是。用封闭袋的方法孵育抗体是我推崇的，可以较好的节约抗体。用封闭袋，7个泳道的膜，用抗体稀释液4 ml，按照1：4000稀释一抗，即用1 ul抗体液就够了，你说做一次WB用1 ul抗体原液算不算节约？！我买的都是国内分装的国外公司的一抗，作WB 10年了，一直还是比较顺利地。

作者: sr9971 时间: 2014-3-16 23:24

我是一次做6个样品（一抗），按1：100稀释。用封口袋效果很好吗？
我用的小试管（每个样品稀释2ML），也很节约。可是这样会不会影响结果？因为我用这个办法怎么做都做不出来

作者: wu11998866 时间: 2014-3-16 23:25

“我用的小试管（每个样品稀释2ML），也很节约。可是这样会不会影响结果？因为我用这个办法怎么做都做不出来” 楼主很有意思，你自己说了“怎么做都做不出来，”那么“也很节约”又有什么意义呢？这不但不是节约，还是无止境的浪费。各人做实验都有自己的心得，无所谓好与不好，自己做起来得心应手的就是好。我一直是用封口袋孵育抗体，肯定是没有问题的，而且也较节约抗体。既然你现在做不出来，应该思考寻找原因。我搞不清楚你所说的用的小试管如何孵育一抗，只是用1：100稀释抗体，看见这行字我心里面就痛！如果读书的时候让我们老板知道用1：100稀释抗体，体无完肤、死无全尸，骂得！
望你试验成功！

作者: jingling845 时间: 2014-3-16 23:26

“我用的小试管（每个样品稀释2ML），也很节约。可是这样会不会影响结果？因为我用这个办法怎么做都做不出来” 楼主很有意思，你自己说了“怎么做都做不出来，”那么“也很节约”又有什么意义呢？这不但不是节约，还是无止境的浪费。各人做实验都有自己的心得，无所谓好与不好，自己做起来得心应手的就是好。我一直是用封口袋孵育抗体，肯定是没有问题的，而且也较节约抗体。既然你现在做不出来，应该思考寻找原因。我搞不清楚你所说的用的小试管如何孵育一抗，只是用1：100稀释抗体，看见这行字我心里面就痛！如果读书的时候让我们老板知道用1：100稀释抗体，体无完肤、死无全尸，骂得！
望你试验成功！

作者: greenbee 时间: 2014-3-16 23:28

我想请教你的封闭袋是什么塑料做的？我用ep手套压成孵育袋，居然发光时发出ep手套的花纹！！可以告诉我是那种封闭袋吗？？
还有：国产的抗体的稀释倍数的确大部分是1：100-1：400。
这种情况下怎么节省抗体呢？我真的很心疼啊。

作者: wu11998866 时间: 2014-3-16 23:28

你好。我还真是没有想明白发光时候怎么会发出ep手套的花纹！！确实有意思。改天我就用EP手套试一试，亲身感受一下。
国产的抗体的稀释倍数的确大部分是1：100-1：400，这个我清楚，即使是进口的也是说500-1000的稀释。我做一抗全部都是中山公司进口分装的（绝无广告之嫌），1：4000，5-7个泳道（一般蛋白都是分离胶跑3 cm停止）都是用4 ml封闭液，加1 ul抗体。为了节约抗体，我一般上样都是40 ug左右，保证有足够的蛋白用于试验。将PVDF膜封闭后，我会现在室温下轻摇1 h，然后放入4度冰箱中过夜，第二天取出后再轻摇0.5 h，然后洗膜。为此，我做一次WB用2天。上午跑胶，转膜，中午开始封闭2-3 h，然后孵育1抗，过夜。以我的经历，要想有效节约抗体，首先要上样蛋白要足够，其次转膜要充分，还有用较高稀释度的抗体时候一定要保证抗体充分与抗原结合，最后，选用好的ECL kit，我一直用的是milliompore的ECL，质量没话说。我们实验室的WB装置从来就没有歇过，有同事疯狂节约，1抗稀释度1：6000（9个泳道，6ml封闭液加1ul抗体），我“骂”他有病，这样做下去抗体公司全要关门。可他就是用1：6000做出来了很多抗体的WB，我还真是佩服。所以说，要想节约抗体，不是那一步的问题，而是整个WB的操作都要规范。
我用的封口膜是从鼎国公司购买的，不贵的。这种膜比较厚，对封口有好处。

作者: leifengta 时间: 2014-3-16 23:29

实在想省的话，把膜反贴在薄膜手套上，保证正面有抗体液接触就可以了。

作者: sr9971 时间: 2014-3-16 23:31

我首先要声明一下啊，我说的1：100稀释的抗体，是指我自己做的单抗腹水啊，做了ELISA测了效价，最后选定这个稀释度的。
我要检测单抗中的抗体是否与目的蛋白发生反应，可惜一直做不出来结果，膜上就是不显示条带。浪费了很多材料，也很心疼。

作者: wiwi 时间: 2014-3-16 23:31

我用蜡皿很省抗体
蜡皿做法很简单，拿一个玻璃瓶皿，里面放一块蜡，加热，然后冷却就好了。
以后把要做的膜放在上面，因为有表面张力的作用，加的抗体都不会留到其他地方去，只要0.5-1ml就足够了，而且基本可以回收。
如果过夜的话记得把蜡皿再放入一个湿盒里，这样放冰箱就不会被蒸发了
但是我不知道这样和放摇床里摇有没有区别。

作者: birdfish 时间: 2014-3-16 23:33

楼上的,这方法虽然是我从别的实验室学来的,但是实践结果效果有区别的,因为膜两头翘起来,这样两端可能不出现条带,而且抗体浓度要求更高浓度,不合算的.

作者: nikun230 时间: 2014-3-16 23:33

我们实验室的做法绝对超省抗体而且效果很好
1.准备一张玻璃板，保鲜膜包裹，粘好，让其一个面保持平整
2.抗体稀释到250ul体积左右，用多大比例的自己算好了，我一次只用2ul
3.稀释好的抗体滴在保鲜膜上，NC膜正面朝下，覆盖在抗体上，注意不要有气泡，而且整个膜都要接触到抗体
4.放在湿盒里孵育，不会干，我们都孵育过夜，没问题
1 2 抗都按这种方法做是不是很省抗体呢？
关键是抗体可以现用现配，每次都用新鲜的，效果也很好
希望大家实验顺利顺利毕业！我也是！

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