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标题: 【求助】底物显色液的配制 [打印本页]

作者: DDD 时间: 2014-3-17 15:19 标题: 【求助】底物显色液的配制

请教各位战友：
我初次做Western Blot ，配制底物显色液的配方是：DAB 4mg，30%的双氧水 15uL，0.01M Tris-cl(pH7.5) 5mL。但是放置了一天，DAB 也没有溶解，请问各位有什么好的方法可以让它溶解呀？还有就是我用的双氧水已经买了一年了，会不会已经失效了，所以DAB 才不溶解的，它应该在使用之前加还是在配制显色液时就可以加上?
另外，配好的底物显色液应该保存在多少度下使用时间可以长一些呀？
先谢谢各位了！

作者: redbutterfly 时间: 2014-3-17 15:20

很多试剂公司可以买 DAB 显色kit，价钱不贵，很方便使用。
你可以看看，国产的挺多。

作者: DDD 时间: 2014-3-17 15:20

我们已经买了粉末状的DAB，如果不用就浪费了，自己配制DAB显色液就没有很好的溶解办法吗？我看园子里以前也有问这个问题的，但是也是没有好的回答。

作者: ending 时间: 2014-3-17 15:21

考虑一下，浪费钱还是浪费时间，哪个更合算?
我认为你买的粉末状的DAB有问题。

作者: lxh031 时间: 2014-3-17 15:22

QUOTE:

原帖由 DDD 于 2014-3-17 15:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教各位战友：
我初次做Western Blot ，配制底物显色液的配方是：DAB 4mg，30%的双氧水 15uL，0.01M Tris-cl(pH7.5) 5mL。但是放置了一天，DAB 也没有溶解，请问各位有什么好的方法可以让它溶解呀？还有就是我用的双氧水已经买了 ...

我没有做过DAB显色，但是从原理来讲，DAB是酶反应的底物，二抗上耦联的酶是催化剂（加速反应），双氧水是反应的供氢体。
因此双氧水和底物必须分开放置，否则即使没有酶参与催化，也有可能缓慢反应。同时说明双氧水对DAB溶解是没有影响的。
其次双氧水放一年是没有问题的，一瓶500ml，每次反应就几个ul，你想能用多久？

作者: DONT 时间: 2014-3-17 15:23

QUOTE:

原帖由 ending 于 2014-3-17 15:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

考虑一下，浪费钱还是浪费时间，哪个更合算?
我认为你买的粉末状的DAB有问题。

我们的DAB是从欣经科买的，一直保存在-20度，应该没有问题的。
俺当然是不想浪费钱也不想浪费时间喽！
再也没有给俺回复的了吗？

作者: DONT 时间: 2014-3-17 15:24

直接问技术支持，有时这招最管用

作者: xyw5 时间: 2014-3-17 15:25

请教各位战友：
我初次做Western Blot ，配制底物显色液的配方是：DAB 4mg，30%的双氧水 15uL，0.01M Tris-cl(pH7.5) 5mL。但是放置了一天，DAB 也没有溶解，请问各位有什么好的方法可以让它溶解呀？还有就是我用的双氧水已经买了一年了，会不会已经失效了，所以DAB 才不溶解的，它应该在使用之前加还是在配制显色液时就可以加上?
另外，配好的底物显色液应该保存在多少度下使用时间可以长一些呀？
先谢谢各位了！
......

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自己配不合算，买现成的底物显色液也便宜

作者: panda王 时间: 2014-3-17 15:26

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原帖由 DONT 于 2014-3-17 15:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

直接问技术支持，有时这招最管用

技术支持不一定啥都懂。呵呵
当然这个电话要打的，说不定态度好，退回去，换成显色kit也不是不可以。。。呵呵

作者: panda王 时间: 2014-3-17 15:26

QUOTE:

原帖由 DONT 于 2014-3-17 15:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我们的DAB是从欣经科买的，一直保存在-20度，应该没有问题的。
俺当然是不想浪费钱也不想浪费时间喽！
再也没有给俺回复的了吗？

对于试验中出现的问题，去寻求答案是一个好事情，但有时候，很恼人的是，有些问题不是你去找，就一定会出答案的。
与其等待，还不如早点想出路，继续下一步的试验，特别是样品已经做好放在冰箱里面，一抗二抗之类的都到货了....趁热打铁啊
同时在想答案也不迟。
DAB 粉剂可以保存很久的，不过除了可以保存起来之外，更建议你和代理讲一下，退货或者换。甚至叫他来做给你看。。。呵呵

作者: yjf1026 时间: 2014-3-17 15:27

QUOTE:

看着搂主这么着急，我免费送您一盒吧，你把详细的邮购地址PM我，我给您寄去，邮寄费用你自己出，行不行？
这样你就又省了钱，又节省了时间。

作者: DDD 时间: 2014-3-17 15:27

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原帖由 yjf1026 于 2014-3-17 15:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

看着搂主这么着急，我免费送您一盒吧，你把详细的邮购地址PM我，我给您寄去，邮寄费用你自己出，行不行？
这样你就又省了钱，又节省了时间。

非常感谢您，我们已经买了中杉的DAB试剂盒了，再次感谢您的热心！

作者: yjf1026 时间: 2014-3-17 15:28

你的配方中少了甲醇。配时是先把DAB 4 mg溶解在PBS 5 ml中，完全溶解后（可能也就几分钟时间）加甲醇400 ul，混匀后最后加30%双氧水8 ul即可，染色时需要避光操作。

作者: avi317 时间: 2014-3-17 15:28

我们的DAB是从欣经科买的，一直保存在-20度，应该没有问题的。
我们的在4度保存了一年多，现在还能用呀

作者: 49888 时间: 2014-3-17 15:29

DAB是有很多杂质不溶，不用管他，按照配方配，如果你担心那些杂质，可以过滤，绝对可以用。我做过上百次了。如果你再加点CoCl2，显色出来的条带会是黑色的，好看一些。呵呵。我的配方是60mg/ml DAB 50ul. 30% H2O2 10ul，0.01mmol Tris(ph7.5) 4500ul,0.3% CoCl2 500ul,总体积5ml. 配好尽快用，放置之后可能会失效。我每次都使用之前配，没有放置超过一个小时。个人感觉显色不用避光，显色后，如果你没过滤DAB（我比较懒，从来不过滤，但Tip头吸的时候会堵，把Tip头尖端剪掉吸就行了或者小心取上清），膜上会有杂质，用自来水冲一下就干净了。
我每次配1mlDAB（60mg/ml)，室温避光保存，从来不放入-20度。DAB粉剂我一直放在室温，大概放了1年多吧，可以用。
H2O2放一年应该还好吧。不放心可以再买一瓶，反正也不贵。买后放置阴凉处，最好取个5ml出来，避光保存。

作者: wmp1234 时间: 2014-3-17 15:30

我当时做WESTERN的时候，显色剂买的是现成的，是在照相管买的，如果嫌报销不方便，可以托试剂公司到照相管买。就是显影粉定影粉各一包，一包就有酸菜鱼调料包那么大的，每一包里面均有三四个小包。然后按照里面的说明书自己配制，每包都能配6L，很多的然后避光保存。
楼主如果自己配制的话，建议：
1，开始做的时候最好还是跟在有经验的人后面学习一下，毕竟WESTERN步骤繁多，如果最后暴光是张白片，都不知道是哪一步出问题。
2，用自己配制的显影剂暴不出来，可以用已经验证过的能用的显影剂暴看一下。
3，对于自己不确定的不知道能不能用的试剂，如果价格便宜的话，尽量换新的吧。
总之，实验中还是时间宝贵抗体值钱模型耗精力，应以这些为主。该省的才省。

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