分析测试百科

标题: 【求助】BL21 和 Rosetta 表达的疑惑 [打印本页]

作者: xevin 时间: 2014-3-17 22:24 标题: 【求助】BL21 和 Rosetta 表达的疑惑

表达一个哺乳动物病毒的N蛋白
克隆到载体上后
开始用BL21表达
虽然量不是很大但还可以接受
－80保存了两三个月
再拿出来划线挑菌诱导同样的条件居然不表达了
于是重新用质粒转化了Rosetta
挑单克隆过夜生长还正常
但第二天1：100转接（Amp Chl）扩大培养就长不起了
10个小时之后浓度还是很低
请大家帮忙分析
一为什么同样的条件BL21开始能表达后来表达不成功
二 Rosetta过夜菌转接的时候能否扩大浓度比如1：10这样？扩大浓度后是否有利于生长有利于表达呢？
谢谢

作者: guagua 时间: 2014-3-17 22:25

估计你的蛋白对宿主菌的毒性较大，而且表达产物是可溶性的，所以用Rosetta后问题更严重，能告诉我你用的是什么载体吗？也许可以帮助你解决。

作者: woshituzhu 时间: 2014-3-17 22:25

我最近也遇到类似的问题，相同的条件，原来能诱导到上清的，现在却不行了，这个跟菌的新鲜的程度有关吗？

作者: woshituzhu 时间: 2014-3-17 22:26

我是5X-1载体的。

作者: xevin 时间: 2014-3-17 22:26

我用的载体是pRSET-C
不过开始在BL21中表达是包含体
但表达量不是很高

作者: guagua 时间: 2014-3-17 22:27

1.如果蛋白需要量较大，建议更换其它载体如pET30a或pET28a(T7lac promoter含 lacI 编码基因)，这样稳定性应该会提高
2.如果蛋白需要量不大，那只能先保存一些质粒，每次做之前转化制备新菌种，或者做一下菌种传代稳定性的研究（如果是我做的话，倒不如更换载体）。
个人认为Rosetta不太适合于规模生产。
菌种的不稳定性现象很常见，原因较复杂，只能找些方法提高稳定性，祝好运！

作者: birdfish 时间: 2014-3-17 22:28

我想问一下你重新转化过BL21么?我也遇到类似的问题,表达菌种在-80保存了半年划线挑菌不表达,后来提质粒重新转化还是不表达,很郁闷,而且用原始质粒转化也没表达,可当初它确实是表达过的呀

作者: eric930 时间: 2014-3-17 22:28

楼上的，
会不会是你的BL21的菌株变异了，
我也碰到过这种情况，后来只能重新买NOVEGIN的新菌株。
TO adihua:
Rosetta不太适合于规模生产, 为什么？

作者: glass 时间: 2014-3-17 22:28

不会是菌株的问题,因为同一个实验室有别人也用的这个菌株表达没问题的

作者: ritou1985 时间: 2014-3-17 22:29

其实你们忽略了一个问题，就是BL21菌株中还带有另外一个质粒，是编码T7RNA聚合酶基因的质粒，而为何我们保存了好久的菌株拿出来想继续表达却发现没有表达图谱了？其中原因就是该菌株中的T7 RNA聚合酶基因被重组丢失了，那么你的表达载体上的启动子就没有用了。建议方法是，每次进行诱导表达前，可以用表达质粒进行转化后，第二天早上待重组菌长出并菌落较小时，挑取接种于液体培养基中，培养到OD600=0.8时，再转接至200ml或更大体积的液体培养基中，继续培养至OD600=0.8时，加入IPTG诱导，至于诱导时间需要自己摸索。这样可以保证表达的成功。
至于Rosetta为何不适宜用于工业化生产，其实与它的表达量有关的，试想一个菌株中拥有N多的质粒或表达框架在里面，那么同样的表达质粒导入，而在别的菌株中就只有一个表达质粒在里面，在相同的培养与诱导条件(即提供的材料量一样)下，可以想像Rosetta菌株中期望的表达质粒能用到的材料量占多少？那么你期望的表达量就肯定不会够了。至于我为何这么说，我已同时做了BL21(DE3)和Rosetta(DE3)为宿主进行表达我的目的基因，就会发现BL21(DE3)为宿主时表达量就会很大，相对来说Rosetta就小了。

作者: misswu61 时间: 2014-3-17 22:29

很想知道现在表达了没

作者: yyaxw84 时间: 2014-3-17 22:29

请问一下:
1.
转化后直接挑克隆到50ml培养基中,
养到OD600=0.6-0.8时再加IPTG诱导,
2.
与先挑在小试管养一段时间,再加一
部分菌液到50ml培养液中,OD600到
0.6-0.8时加IPTG诱导,
这两种方法有啥区别呢?
10楼gxumxc:你好,请问分两次培养,
那个含T7 RNA聚合酶的质粒就能重
新形成吗???
我前天直接挑克隆到50ml培养液中,
养到OD=0.8时加IPTG,啥也没诱导出
来!正郁闷.....

作者: birdfish 时间: 2014-3-17 22:30

本人不太同意“BL21菌株中还带有另外一个质粒，是编码T7RNA聚合酶基因的质粒”的观点，如果是这样的话，从转化了表达质粒的BL21（BE3）菌中抽提的质粒就会有两种质粒，可我还没见过这样。T7RNA聚合酶应该是在BL21（DE3）基因组的DE3区，启动子是lacUV5，同样受是IPTG的诱导。
To fanxing518:两种方法诱导都可以。不同基因的表达，难度不一样，受很多因素的影响，最主要的是基因（蛋白）的特性（大小、密码子、5‘端二级结构等、产物毒性等）、载体的选择，采用何种形式表达（融合or 非融合），如果一个基因实在很难表达（如对菌体有毒性），可以采用融合表达，使之形成包涵体，也许会好些。不同的蛋白要具体分析。不知道有没有人在开发这种预测蛋白表达的软件之类的？
To erwinchen:Rosetta不太适合于规模生产, Rosetta菌种的生长速度会慢些，最主要的是工业化生产中如制药，一般不加抗生素，这样含多个质粒的Rosetta就更不稳定，不好控制发酵工艺。

作者: jude 时间: 2014-3-17 22:30

我也出现了这样的问题.以前做好了的重组菌,现在拿来诱导,更本诱导不出,而且和BL21菌对照了一下,发现重组菌不表达了.这到底是怎么回事?

作者: bling 时间: 2014-3-17 22:31

我现在也遇到相同的情况，我的片断长度是1800bp

作者: bling 时间: 2014-3-17 22:31

我现在也遇到相同的情况，我的片断长度是1800bp，用的是Pet32载体，上个月表达的时候，虽然量少，但还是可以看出表达了，但现在怎么也不表达了，请教同实验室的博士，他说他以前也遇到同样的情况，通过更换培养基的方法解决了，我采用同样的方法，还是没有表达。请有这方面经验的大虾们来帮帮啊！
上面有位同学说是编码T7 聚合酶的质粒丢了，这肯定是不对的。编码T7 RNA聚合酶的基因是整合到宿主菌基因组里面的（Lac操纵子下游），在不加IPTG时，被Lac蛋白阻遏表达，加入IPTG时，能诱导T7 gene的表达，生成的T7RNA聚合酶识别我们转化进去的质粒上的T7 RNA启动子，从而使我们的插入基因大量表达。

作者: njkph 时间: 2014-3-17 22:32

我最近也遇到这种情况，连续作了三个月都是保种后重新划平板就不表达了，质粒测序也是对的，但一直找不出原因来，今天看了各位的帖子如梦初醒啊，明天重新转化再表达，谢谢各位啊

作者: ha111 时间: 2014-3-17 22:32

很可能是质粒丢失，BL21很容易丢失质粒，一般质粒都保存在JM109和DH5a中比较稳定。我们实验室也有一些人出现这种情况的！

作者: 莲花白 时间: 2014-3-17 22:33

质粒丢失了，在抗性平板上怎么长的起来？

作者: ROSE李 时间: 2014-3-17 22:34

我现在遇到相似的问题。我的载体是pET28a和pET32a，连的同一个基因，1.5Kb。在BL21中二者都可以表达，但都不溶。转到rosetta中之后，pET32a仍表达，但还是不溶，而pET28a的竟不表达了。请问这是何故？请大家帮帮忙吧！

作者: sunnyB 时间: 2014-3-17 22:34

我建议还是换个载体吧比如PET-28A

作者: ending 时间: 2014-3-17 22:35

这个问题好像以前讨论过
做过蛋白表达的90%都会遇到这种问题，为什么会出现这种情况，我个人理解是 1 菌种活力下降 2 在BL21摇菌和保存时蛋白泄露表达，对细菌产生影响 3 在BL21 里质粒被修饰了，在BL21中，质粒不稳定，但原因还不是很明确
解决方法：保存质粒而不是BL21 重组菌，每次准备表达时都用质粒重新转化，挑选高表达菌种进行大量表达。

作者: sunshine039 时间: 2014-3-17 22:35

还有要注意的（我的经验）：大量摇菌表达前，先要划板挑若干单菌落做小量诱导表达，在上样量相同的情况下，我们能看到他们的表达量是不同的，保存表达量高的单菌落，尽快大摇表达，如果放时间过久，还得划板挑克隆选取表达高的单菌落大摇（虽然都来源于一个单克隆菌，但是划板后每个克隆表达量又有不同，原因不明，望大家赐教），这样能尽可能得到高表达。
另外，选Rosetta的原因，是因为它能满足一些稀有密码子的表达，BL21则不行（导致有些蛋白不表达），所以我们有时候不得不选前者。毕竟能出结果是最重要的

作者: purrr 时间: 2014-3-17 22:35

我把转化的板子一直在4度保存着，每次要做的时候就从上面挑一个斑，我觉得也挺方便的，板子存一个月应该没有什么问题的！
要是重新转化质粒，还是很麻烦的，Rosetta那么多抗性，倒个平板都很繁琐

作者: TAT 时间: 2014-3-17 22:36

我也遇到了同样的问题，郁闷呀。到现在也表达不出来了。

作者: 逗号是句号 时间: 2014-3-17 22:36

以前BL21能表达，就没必要换到Rosetta中。同意以上多位战友的意见，用新鲜转化的菌！
大量生产的话可以用BL21 DE3 Star，一般来说表达量要高很多。当然载体也是一个因素，但同样的载体一般来说这个菌株的表达量更高. Invitrogen 的说明书上说：
The BL21 (DE3) Star cells contain a mutation in the gene encoding RNaseE (rne131), which is one of the primary enzymes involved with mRNA degradation in E. coli. This mutation significantly improves the stability of mRNA transcripts and thus increases protein production.
mRNA在宿主中的稳定性也是影响表达量的一个因素，这个菌株就是通过提高这一点达到的。

作者: 2541 时间: 2014-3-17 22:37

这问题我也遇到过,非常郁闷. 只能每次都重新转化.当时为了这个问题耽误了我很长时间.

作者: okhaha 时间: 2014-3-17 22:39

BL21中质粒不稳定是因为：BL21不像DH5a，JM109那些克隆用菌一样是DNA酶缺陷型，所以时间一长，BL21中的外源质粒有可能会被降解，而克隆用菌中的质粒则相当稳定。
至于为什么BL21中的外源质粒丢失后，还能在相应抗性的平板上长出来的问题是因为：BL21不是RecA缺陷型。质粒上的抗性基因有可能被整合到菌的基因组上，所以质粒丢失后还能在相应的平板上长出来。
其实很多问题都可能在基因型上找出原因。。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)