分析测试百科

标题: 【讨论专区】蛋白质组学研究方法 [打印本页]

作者: ukonptp 时间: 2014-4-2 22:17 标题: 【讨论专区】蛋白质组学研究方法

蛋白质组学研究方法专区！请发表高见！

作者: ukonptp 时间: 2014-4-2 22:20

先介绍一个网站:
cuturl('http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/proteome/index/index.htm')
cuturl('http://cmbi.bjmu.edu.cn/') 中国生物医学信息网
很多的介绍文章.很不错的.

作者: birdfish 时间: 2014-4-2 22:21

蛋白质组学不需要方法，只需要仪器。用荧光标记的样品跑2D，三维峰形显示分析软件分析，带机器人的workstation全自动实现扫描、抠点、脱色、干燥、酶解、孵育、点样，然后往maldi-tof一扔。一次1152个样品，我就不信做不出成果来！
可惜，这套东东买得起人不多

作者: xingyi08 时间: 2014-4-2 22:22

我在expasy上下载了Melanie 3，可惜只是个演示版。网上有其它的分析2D胶的免费软件吗？
俺们实验室穷买不起公司的（1万多美金呀），如果哪位大侠的实验室有分析2D胶的软件，不知能否借用一下。小弟不甚感激！

作者: yyaxw84 时间: 2014-4-2 22:23

请教MALDI-TOF肽指纹图的数据库查询的具体方法？
甚末数据库？
怎末打分？
结果出来怎末分析？
急！！！
先谢了！！！

作者: remonte 时间: 2014-4-2 22:23

我现在正考虑做这方面的工作，但对蛋白质组的东西一点都不了解。2D电泳的蛋白上样量有多大？提蛋白时有什么要求？做出差异后，胶上的蛋白可否进行质谱分析？质谱分析能估出多少个氨基酸？准确程度有多少？
请不吝赐教。

作者: jujuba 时间: 2014-4-2 22:24

cuturl('http://ca.expasy.org/sprot/')
搞蛋白不能不知道这个网站，可用以查蛋白氨基酸序列，及domain！

作者: fqswdzd 时间: 2014-4-2 22:24

推荐《蛋白序列比较与蛋白进化教程》英文版，PDF格式，2.4M
下载网址 cuturl('http://www.people.virginia.edu/~wrp/papers/ismb2000.pdf')

作者: fqswdzd 时间: 2014-4-2 22:26

整合了生化学家研究蛋白最基本的运算与分析。主要功能有：Amino Acid Analysis, Building Block Sort, Digestion, Elemental Analysis, Mass Fragmentation, HPLC Retention Pattern, Isotopic Profile, Combinatorial Library, Molecular Weight, Sequence Parameters, Charge-pH Profile
下载网址 cuturl('http://www.legend2000.com/aminoXpress/software/amiXControls502.zip')
使用手册 cuturl('http://www.legend2000.com/aminoXpress/software/AmiManual50RTF.zip')
中文使用说明书 cuturl('http://www.bio-soft.net/down/aminoXpressCN.pdf')

作者: kuohao17 时间: 2014-4-2 22:27

向大家推荐一个国内较好的蛋白质组学网站。
cuturl('http://www.proteomics.com.cn/')
希望对大家有帮助。
上面有好多好好东东，可惜我不搞蛋白质。

作者: Ao7 时间: 2014-4-2 22:29

请教MALDI-TOF肽指纹图的数据库查询的具体方法？
甚末数据库？
怎末打分？
结果出来怎末分析？
急！！！
先谢了！！！
......

==============================================================================================================

由于MALDI-TOF只是根据肽段的特征给出相关数据，并不能精确给出肽段的序列，同时，不同肽段的数据的组合可能会在结果上有一定的出入，因此，肽指纹图的数据库上的打分只能做为参考。运气好的话可以查到特异性较高的蛋白序列。（打分在65分以上）运气不好就根本查不到。尤其当研究的蛋白为未知蛋白时。
最近国内部分实验室好象要上新的质谱仪，在质谱同时进行末端测序，可测30个氨基酸左右。这样质谱的结果对蛋白的分析就精确多了。具体情况你可向法玛西亚公司咨询。
祝，好运！

作者: Ao7 时间: 2014-4-2 22:29

我现在正考虑做这方面的工作，但对蛋白质组的东西一点都不了解。2D电泳的蛋白上样量有多大？提蛋白时有什么要求？做出差异后，胶上的蛋白可否进行质谱分析？质谱分析能估出多少个氨基酸？准确程度有多少？
请不吝赐教。

=============================================================================================================

先谢谢你提供的质粒。
2D电泳的蛋白上样量有多大？
我们实验室一般100微克到800微克。100微克做分析，700-800微克做质谱。根据你的实验，你先要摸摸条件，因为上样量小了，有些点就没有了。上样量大了，蛋白太浓分不开。
提蛋白时有什么要求？
根据你实验的要求，一般要冷冻离心。其他如蛋白的甲基化、磷酸化等则根据你的实验来定。不同需要细胞的破碎方法也不同。
胶上的蛋白可否进行质谱分析？质谱分析能估出多少个氨基酸？准确程度有多少？
可以，将感兴趣的点抠出，胰酶消化、抽提、干燥后，就可做质谱了。至于准确度，看我发的上一个贴子。如有问题，尽管说，或直接发在我的信箱里也行。

作者: jiushikeshui371 时间: 2014-4-2 22:30

几个提供蛋白测序的地方：
军科院仪器分析中心
上海基康生物技术有限公司
北京赛百盛生物工程公司
中科院上海生物化学研究所
北京大学生命科学院
湖南师范大学蛋白质化学实验室

作者: okhaha 时间: 2014-4-2 22:30

推荐：Proteomics: A Trends Guide I
cuturl('http://journals.bmn.com/supp/browse/issue?jcode=supp&supcode=2000%4001')
Protemics: A trends Guide II
cuturl('http://journals.bmn.com/supp/browse/issue?jcode=supp&supcode=2001@19')
Trends in Biotechnology的两期蛋白质组学特刊，
免费下载的，要先注册。
我已经全下了!

作者: okhaha 时间: 2014-4-2 22:32

再给大家介绍一个蛋白质研究方面的网站：3D-PSSM
是基于WEB的蛋白质折叠识别研究服务。可以提交1D和3D蛋白序列数据来计算蛋白质的二级结构和溶解性。

作者: kuaizige 时间: 2014-4-2 22:32

2D-PAGE结合MALDI-TOF质谱分析法费时费力，请大家关注SELDI-TOF质谱分析法!有兴趣的朋友可以浏览
cuturl('www.ciphergen.com.cn')

作者: chuntian1983 时间: 2014-4-2 22:33

应用于2-de分析软件：
1 Delta 2D2 GELLAB II 3 Melanie 4 PD Quest 5 Phoretix 2D
5.2 Image Master 2D Elite5.3 InvestigatorHT Analyzer 6 Progenesis 7 Z3
8 proteomweaver
其中PD QUEST是bio－rad公司的，有多个版本。可免费试用。其中6.2版试用期为一个月，试用期内无功能限制。对于没有money的朋友来说不失为一很好的选择。我在的试验室用的是Image master，界面友好，使用时较其他几款容易上手。Melanie也有30天免费使用的。可到相应网站看看。
pd quest：cuturl('http://www.bio-rad.com')
melanie：cuturl('http://www.genebio.com')
Z3：cuturl('http://www.2dgels.com')

作者: 12xunmei 时间: 2014-4-2 22:33

我们实验室专门做蛋白，不过我是新手，知道的不多，有什么问题大家可以讨论一下。
酵母双杂交，哺乳动物双杂交，GST 融合蛋白系统，GST沉降都是研究蛋白质的方法。
蛋白质之间的相互作用，蛋白质和DNA之间的相互作用很微弱，而且需要细胞内环境，普通的生物化学方法很难进行研究，因此蛋白质的研究滞后与DNA。
酵母双杂交，哺乳动物双杂交，是用两个载体分别带有编码GAL-4的AD(activation domain)与BD(binding domain)亚基的基因，在其后分别连接上我们要研究的蛋白编码基因。两种载体与另一个带有report基因的载体共转染酵母或哺乳动物细胞，如果所研究的两种蛋白有作用，则GAL4的AD与BD段将大量结合，report基因将大量表达，供我们检测。这两个系统都很不错，他们都是真核表达系统，能正确修饰蛋白，还有“区室”效应，很方便。
我用CLONTECH的盒子作的，效果不错！
GST Fusion Proteins System 对于蛋白的研究更有优势，借用一下：
cuturl('http://www.jiansuo.net/cgi-bin/ut/topic_show.cgi?id=32219&h=1&bpg=2&age=60')
另外，有什么方法研究蛋白间相互作用的，介绍一下！！

作者: XYZQ 时间: 2014-4-2 22:34

MALDI-TOF肽指纹图的数据库查询一般使用随质谱仪带的本地蛋白数据库检索，当然，这个数据库是开放的可以随时下载网上的最新数据。其评分原则是根据实际的肽段分子量与理论预测的分子量的相似程度。分值越高，就越相似。当然，不同软件的评分还有差异。如Proquest和Mascot就不太一样。推荐ABI公司的4700配的GPS explorer软件，很不错。

作者: njkph 时间: 2014-4-2 22:35

偶现在在家，没设备，但是也可以做。
现在蛋白质学研究方法
个人觉得应人结构生物学方面入手，
很多东西，不是靠很怎么样的设备，
多动动脑子很重要，
就像有计算器了，口算一些小数学都产生依赖。

作者: 3648755 时间: 2014-4-2 22:35

A Guide to Protein Isolation(3.65M),需要者见：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=86&id=174385&tpg=1&ppg=1&sty=1')

作者: 兔唇 时间: 2014-4-2 22:36

你的体会用双杂交找新的相互作用蛋白风险多大？周期多长？
我需要找一个膜表面蛋白的配体，但我们实验室是搞基因的，蛋白做的少，能否与你们合作。你们在上海吗？
不知谁知道上海谁做的好？因为我们想短期内得到这个配体。
不知在双杂交以前，配体和受体是如何找到的？

作者: uuooii 时间: 2014-4-2 22:37

我想做对肠道平滑肌细胞内钙调蛋白的检测，请问有没有对检测细胞内钙调蛋白有经验的同志，指点一下迷津，非常感谢!!

作者: PINK 时间: 2014-4-2 22:38

你的体会用双杂交找新的相互作用蛋白风险多大？周期多长？
我需要找一个膜表面蛋白的配体，但我们实验室是搞基因的，蛋白做的少，能否与你们合作。你们在上海吗？
不知谁知道上海谁做的好？因为我们想短期内得到这个配体。
不知在双杂交以前，配体和受体是如何找到的？
......

=============================================================================================

　　不好意思!我很久没来。
　　我不在上海，而且相距很远，帮不到你了！
　　不知你指的风险是什么？是假阳性么？如果是的话，那么风险很大。
　　用酵母双杂交假阳性较高，但如果用多个报告基因，就可以弥补之。酵母双杂交的周期大概１个月！算不算长呀？
　　你首先要用文库来筛呀！有文库么？

作者: mingming0638 时间: 2014-4-2 22:39

......

　　我不在上海，而且相距很远，帮不到你了！
　　不知你指的风险是什么？是假阳性么？如果是的话，那么风险很大。
　　用酵母双杂交假阳性较高，但如果用多个报告基因，就可以弥补之。酵母双杂交的周期大概１个月！算不算长呀？
　　你首先要用文库来筛呀！有文库么？
　　有事在联系!
不好意思,刚才发完帖子才发现用的是别人的号!见谅!!!

作者: 7437654 时间: 2014-4-2 22:40

请问各位大侠如何从组织中提取蛋白,多谢!

作者: bling 时间: 2014-4-2 22:40

请问楼主和各位专家：怎样从培养细胞提取多肽（与蛋白质提取有和不同）？2-D电泳能否分离这种小分子蛋白质多肽？

作者: feima+ 时间: 2014-4-2 22:40

1。蛋白质组学研究我个人经验认为是一个多种蛋白方法的综合。例如可将HPLC, DEAE离子交换层析等技术融合。
2. 2D电泳的关键是标本的处理。标本的质量直接影响2D的成功。
3.2D仅仅是一个初筛技术。需要进一步进行差异蛋白的功能分析，包括免疫，结构分析以及应用。

作者: queen 时间: 2014-4-2 22:41

请问各位大侠如何从组织中提取蛋白,多谢!
Re: 可以用玻璃匀浆器匀浆，先在匀浆器里加入适量的蛋白裂解液如三去污等，将组织剪成小碎块，至于匀浆器中匀浆即可，整个过程应在冰浴的条件下进行，动作要快一些，后续步骤同细胞裂解。

作者: idoww 时间: 2014-4-2 22:42

请问,有谁知道RasMal2.6怎么用?对蛋白质晶体结构真的搞不清楚

作者: wu11998866 时间: 2014-4-2 22:42

相关疾病：
肿瘤
想作蛋白组学的朋友们可以看看此书
陈主初，梁宋平主编：《肿瘤蛋白质组学》，湖南科技出版社，长沙书价不贵，为22元
该书详细讲述了肿瘤蛋白组学的研究方法和原理，蛋白组学的研究策略。当然也详细给出了作2－DE的蛋白质提取方法，注意事项，是一本不错的参考书。
请大家不要以为我是推销员，我近来也在看蛋白组学相关的内容，有机会看到此书，与大家分享。

作者: youyou99 时间: 2014-4-2 22:43

个人见解：
1.主流方法凝胶中跑2-D后，收集后蛋白测序，对照数据库。
2.先进行2－D HPLC，然后用32Karat软件进行差异显示，最后用MS进行结构分析。
两者都比较花钱，前者适合纯化后量多的蛋白分析，后者适合微量至痕量蛋白分析。
请问病变细胞与正常细胞的蛋白差异性研究，如何入手？
病人血清蛋白与正常人血清蛋白的差异性研究有意义吗？

作者: ukonptp 时间: 2014-4-2 22:43

请问病变细胞与正常细胞的蛋白差异性研究，如何入手？
病人血清蛋白与正常人血清蛋白的差异性研究有意义吗？

==============================================================================================================

这个概念非常好，实际上蛋白组学的一个很大的课题就是比较不同条件下的蛋白差异性。但是在实践中，蛋白差异性研究非常复杂。蛋白表达有时空两个向量。
按DNA表达的时间向量，主流的pilot实验方法是microarray；然后是PTM比较，经典的方法如你所言2D-gel或新一点的2D色谱或***色谱；
按表达的空间向量，主流的pilot实验方法是荧光标记照相；新一点的用quantitative质谱(比如用同位素标记源自正常细胞的蛋白，来自不同细胞的同一蛋白酶解呔段在谱图上就会有质量差)；
血清中东西太多，建议还是选择特征靶蛋白(群)研究。基於组织的蛋白组研究有报道，但目前还多是展望性研究，或靠大资金支持，throughput很低的。

作者: daod 时间: 2014-4-2 22:44

相关疾病：
结直肠癌
病人血清蛋白与正常人血清蛋白的差异性研究有意义吗？
我们应用SELDI-TOF-MS对大肠癌和健康人以及大肠息肉患者的血清进行了研究，有很多有意义的发现。
cuturl('www.zuci.org')

作者: greenbee 时间: 2014-4-2 22:44

我这儿有些请看看:
cuturl('http://www.google.com/search?q=%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8+filetype%3Appt&ie=UTF-8&oe=UTF-8&hl=zh-CN&lr=')

作者: TAT 时间: 2014-4-2 22:45

请问你们实验室在哪里?
提供样品检测吗?
收费或是联合?
我的博士课题有部分可能涉及到SELDI-TOF-MS方法检测标本.
谢谢

作者: ukonptp 时间: 2014-4-2 22:46

QUOTE:

原帖由 TAT 于 2014-4-2 22:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问你们实验室在哪里?
提供样品检测吗?
收费或是联合?
我的博士课题有部分可能涉及到SELDI-TOF-MS方法检测标本.
谢谢

在浙江大学肿瘤研究所
提供样品的检测，请问你有多少样品？
由于Ciphergen公司抬高了芯片的价格，所以，我们对样品的检测也提高到每例300元。

作者: 不请自来 时间: 2014-4-2 22:46

推荐一个网站：包含了蛋白质各种信息资源！
cuturl('http://pir.georgetown.edu/')

作者: coolcool 时间: 2014-4-2 22:46

前段时间有几个双向胶上的蛋白点拿到北京华大基因作MALDI-TOF质谱鉴定，公司的人说角蛋白污染严重，结果不可信。在操作过程中我已做到很小心了。很郁闷啊!请教高手：角蛋白污染主要发生在哪个过程？如何减少角蛋白污染？是不是在整个双向电泳的过程中都必须用进口试剂和MILLI Q水？另外，国内还有哪些单位可作质谱鉴定(价格低点的)。谢谢

作者: shanzhapia696 时间: 2014-4-2 22:47

相关疾病：
痛风
角蛋白污染也可能发生在样品处理得过程中，例如没有戴帽子或者帽子戴得不好，工作台通风用的filter不干净，一次性手套蘸到了脏的东西等等。不一定是电泳过程中发生的。

作者: 箭头儿 时间: 2014-4-2 22:48

集中讨论蛋白质组学研究方法，真不错！我们实验室也有一整套蛋白质组学研究仪器和方法，包括２－DE、***液相色谱、MALDI-TOf－MS、ESI-ion-trap－LC-MS等，做蛋白质的分离、鉴定，蛋白质的差别谱的建立等都没问题。

作者: junhun 时间: 2014-4-2 22:48

前段时间有几个双向胶上的蛋白点拿到北京华大基因作MALDI-TOF质谱鉴定，公司的人说角蛋白污染严重，结果不可信。在操作过程中我已做到很小心了。很郁闷啊!请教高手：角蛋白污染主要发生在哪个过程？如何减少角蛋白污染？是不是在整个双向电泳的过程中都必须用进口试剂和MILLI Q水？另外，国内还有哪些单位可作质谱鉴定(价格低点的)。谢谢

============================================

做任何一步必须戴口罩，戴帽子，手套那更是不用说。

作者: 12xunmei 时间: 2014-4-2 22:49

我们这里也已经可以做双向和质谱,而且技术已经基本成熟,从双向到质谱鉴定整个周期可以控制在5天左右.

作者: 箭头儿 时间: 2014-4-2 22:49

关于胰蛋白酶酶自解和角蛋白的污染，献上小弟的心得一则，欢迎各路高手指点！
（四）关于胰蛋白酶酶自解和角蛋白的污染
首先，要尽量降低蛋白酶酶自解,减少角蛋白的污染，因它们“额外”的肽段会干扰质谱检测得到的数据的分析，主要的防护措施有以下几点：
1.  使用TPCK-Trypsin(质谱级)，Promega和Roche公司均有较好产品
2.  在加酶使胶块吸胀后，一定要打掉多余酶液，不要认为这样会影响酶解的效率
3.  酶解时间不宜过长，不要超过24小时
4.  电泳的玻璃板、染胶的器皿等用前洗净
5.  所用试剂和溶液的纯度要高，以便达到质谱分析的要求
6.  尽量使用干净的乳胶手套和洁净的EP管及Millipore H2O
7.  尽量减少不必要的操作步骤，简化操作程序
8.  要有一个洁净的操作环境
但有时蛋白酶酶自解和角蛋白的污染还是难以避免的，那么有必要在数据存储或采集数据时将它剔除，提高搜库的有效性和准确性，同时它们也可以作为内标准物校准仪器(Porcine Trypsin：842.5100和2211.1046，M+H+)，相对外标准物有更高的精确度，下面两个列表表示porcine(表16.1)和bovine(表16.2)胰蛋白酶酶自解理论肽谱(中性，相对分子质量值)。porcine和bovine胰蛋白酶的全序列参考cuturl('http://biochem.roche.com/pack-insert/1418475a.pdf')以及华盛顿大学生物化学系的关于胰蛋白酶的文献[17]。
常见的对质谱影响较大的角蛋白有以下四种：角蛋白1(皮肤)、角蛋白2E(头皮屑)、角蛋白9(皮肤)、角蛋白10(头皮屑)，介于篇幅，不再展开讨论。详情请参见：cuturl('http://www.matrixscience.com/') Help Topic Index：Protein chemistry中autolysis和contaminants选项。

作者: hulu呼噜 时间: 2014-4-2 22:49

我也有同样的问题:
请教MALDI-TOF肽指纹图的数据库查询的具体方法？
甚末数据库？
怎末打分？
结果出来怎末分析？

作者: dhpbj 时间: 2014-4-2 22:50

关于胰蛋白酶酶自解和角蛋白的污染，献上小弟的心得一则，欢迎各路高手指点！
（四）关于胰蛋白酶酶自解和角蛋白的污染
首先，要尽量降低蛋白酶酶自解,减少角蛋白的污染，因它们“额外”的肽段会干扰质谱检测得到的数据的分析，主要的防护措施有以下几点：
1.  使用TPCK-Trypsin(质谱级)，Promega和Roche公司均有较好产品
2.  在加酶使胶块吸胀后，一定要打掉多余酶液，不要认为这样会影响酶解的效率
3.  酶解时间不宜过长，不要超过24小时
4.  电泳的玻璃板、染胶的器皿等用前洗净
5.  所用试剂和溶液的纯度要高，以便达到质谱分析的要求
6.  尽量使用干净的乳胶手套和洁净的EP管及Millipore H2O
7.  尽量减少不必要的操作步骤，简化操作程序
8.  要有一个洁净的操作环境
但有时蛋白酶酶自解和角蛋白的污染还是难以避免的，那么有必要在数据存储或采集数据时将它剔除，提高搜库的有效性和准确性，同时它们也可以作为内标准物校准仪器(Porcine Trypsin：842.5100和2211.1046，M+H+)，相对外标准物有更高的精确度，下面两个列表表示porcine(表16.1)和bovine(表16.2)胰蛋白酶酶自解理论肽谱(中性，相对分子质量值)。porcine和bovine胰蛋白酶的全序列参考cuturl('http://biochem.roche.com/pack-insert/1418475a.pdf')以及华盛顿大学生物化学系的关于胰蛋白酶的文献[17]。
常见的对质谱影响较大的角蛋白有以下四种：角蛋白1(皮肤)、角蛋白2E(头皮屑)、角蛋白9(皮肤)、角蛋白10(头皮屑)，介于篇幅，不再展开讨论。详情请参见：cuturl('http://www.matrixscience.com/') Help Topic Index：Protein chemistry中autolysis和contaminants选项。
......

=============================================================================================================

兄弟出手,必是精品,兄弟是不是在夏其昌老师那里?
cuturl('http://www.matrixscience.com/') Help Topic Index：Protein chemistry中autolysis和contaminants选项。这个网站尽管偶经常上,但偶还从来没有注意到角蛋白理论方面的东西,经您提醒,万分感谢!

作者: 大白菜 时间: 2014-4-2 22:51

病人血清蛋白与正常人血清蛋白的差异性研究有意义吗？
我们应用SELDI-TOF-MS对大肠癌和健康人以及大肠息肉患者的血清进行了研究，有很多有意义的发现。
cuturl('www.zuci.org')

====================================================================================

但SELDI的结果只是抽象数据信息,对于再深成次研究没有提示作用啊,你说的有意义发现指的仅是biomarker吗?

作者: 箭头儿 时间: 2014-4-2 22:53

但SELDI的结果只是抽象数据信息,对于再深成次研究没有提示作用啊,你说的有意义发现指的仅是biomarker吗?
我想目前大多数应该还是指这个（biomarker），不过我觉得这可能不是“真相”，当然不是没有意义，哈哈
昨天在生科院听了一个博士生的报告，讲的是SYSTEMBIOLOGY的讲座，真的很受启发，现在的学生思维真的很活跃，很跨越，他的报告我没有记录，因为真的不想记，哈哈，只想听，他的最主要的思想是现在的生物学家开始“think in model”,这是他在日本开的有关系统生物学会HOOD， L（系统生物学创始人之一）讲座的感想，HOOD， L这个人我想我应该好好去看看他的文章了阿

作者: skytree 时间: 2014-4-2 22:54

做蛋白质之间的相互作用，最新的一种仪器，Biacore system，你们可以到其网站上看看。如果感兴趣可以和我联系。我们实验室有Biacore3000。ww.biacore.com

作者: 喵咪 时间: 2014-4-2 22:54

对于想了解双向凝胶电泳的同仁来说，我以为AMERSHAM的双向凝胶电泳实验手册不错，可相公司索取，免费的。

作者: 喵咪 时间: 2014-4-2 22:55

我觉得质谱样品中角蛋白的污染主要在于空气，我在国外时看老外做质谱时，没穿工作服、没戴帽子、没戴手套，结果照样好得很，我问他们，他们感到很惊讶，想必大概是国情不同所致吧！

作者: ritou1985 时间: 2014-4-2 22:55

2D Electrophoresis using immobilized pH gradients - Principles and Methods
cuturl('http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/literature_intro')

作者: ritou1985 时间: 2014-4-2 22:56

2D Electrophoresis using immobilized pH gradients - Principles and Methods
cuturl('http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp01077.nsf/Content/literature_intro')
thanks!!! much time to download!

作者: yyaxw84 时间: 2014-4-2 22:56

请问2-D系统伯乐和法玛西亚的，哪个公司的好？

作者: 喵咪 时间: 2014-4-2 22:56

如果就系统而言，我以为没有太大分别，但胶条好像是AMERSHAM的要好一点，层析和电泳可是AMERSHAM的强项，仅是我个人意见噢。另外，第二相电泳能跑24CM的AMERSHAM有可同时跑六块胶的，十二块很累人的，除非高通量。

作者: 轰轰 时间: 2014-4-2 22:57

* 角蛋白污染问题：防不胜防。楼上说国外实验室不厉害，不是吧。
倒是各种防污染措施（楼上已提到）做足，CBB染色就应不见了。银染时还存在，不知如何了。理论上的预防方法都有介绍，开工还是存在啊。
* SELDI除了使用的抗原/抗体芯片外，还不能鉴定蛋白质。另MALDI（SELDI后面的检测仪也是）对普通蛋白质分子（数十KD大小）测不准的。cuturl('http://www.ciphergen.com.cn/')
* 开展2D不难，20万RMB可用AMEISHAM的了，当然消耗品贵，不过做熟了自己配试剂可节约不少钱的。
*请问：
是否能用Immobiline做板胶IEF？理论上似乎可以，请指教

作者: yes4 时间: 2014-4-2 22:58

2D电泳的蛋白上样量有多大？
我们实验室一般100微克到800微克。100微克做分析，700-800微克做质谱。根据你的实验，你先要摸摸条件，因为上样量小了，有些点就没有了。上样量大了，蛋白太浓分不开。
提蛋白时有什么要求？
根据你实验的要求，一般要冷冻离心。其他如蛋白的甲基化、磷酸化等则根据你的实验来定。不同需要细胞的破碎方法也不同。
胶上的蛋白可否进行质谱分析？质谱分析能估出多少个氨基酸？准确程度有多少？
可以，将感兴趣的点抠出，胰酶消化、抽提、干燥后，就可做质谱了。至于准确度，看我发的上一个贴子。如有问题，尽管说，或直接发在我的信箱里也行。
......

==============================================================================================================

最近我做了次2-DE，但是出来的点很少且浅，估计是上样量不够，我曾用BCA和BRADFFORD两种方法测过蛋白浓度，好象都不可靠，请问您是用什么方法进行蛋白定量的？谢谢！

作者: bluelake 时间: 2014-4-2 22:58

楼上说的偏激了.我们这里除了没有全自动的工作站,仪器也算全的了.凑巧我也正在从2D到MALDI-TOF-TOF的做,算是现在蛋白组学的一整套技术了.我的体会就是它象其他领域一样,方法很重要.就是别的实验使用的很好的现成的方法,用在自己的实验室也需要修改优化.不是有仪器就可以的.

作者: purrr 时间: 2014-4-2 22:59

BCA法、BRADFFORD法都测不准，我们使用的是AMERSHAM专门针对2D的测蛋白浓度试剂盒2D QUANT KIT，感觉挺准的。其基本原理就是把蛋白质沉淀下来，去除裂解液，再重溶蛋白质，再测浓度。各位有兴趣可以试试。或者自己配点试剂做做。

作者: 子衿青青 时间: 2014-4-2 22:59

相关疾病：
肝癌
SELDI-TOF-MS浙大将肝癌血清应当也测完了，郑树在美国84癌症大会上有发言，只是我只读了摘要，未能读到发言全文。

作者: 101010 时间: 2014-4-2 23:00

没错，蛋白质组学要的是仪器和钱，方法上已成公式了

作者: jingling845 时间: 2014-4-2 23:00

请问一个很菜的问题，我马上要进行蛋白质组研究，之前，看了有关蛋白质浓度测定的方法，在一本书上介绍的bradford方法中，试剂栏磷酸浓度为85％，而后面储存液和工作液浓度均为88％，我不知道到底是哪一种浓度，现求助大家。

作者: 大海啊故乡 时间: 2014-4-2 23:01

楼上兄弟你可以根据试剂浓度比例求出相应的体积。
我们一般不配储液直接配成工作叶，效果挺好。
附配方：
g-250考马斯亮蓝 7mg
乙酸（99.7%） 4.75ml
磷酸（85%） 10.35ml
用双蒸水定容至100ml
再过滤

作者: xue258 时间: 2014-4-2 23:01

SELDI-TOF-MS浙大将肝癌血清应当也测完了，郑树在美国84癌症大会上有发言，只是我只读了摘要，未能读到发言全文。

==================================================================

相关疾病：
肝癌

可以介绍更多关于浙大测肝癌血清方面的资料吗?我正在搞血清蛋白质组这一块,谢谢!

作者: zhihui小新 时间: 2014-4-2 23:02

BCA法、BRADFFORD法都测不准，我们使用的是AMERSHAM专门针对2D的测蛋白浓度试剂盒2D QUANT KIT，感觉挺准的。其基本原理就是把蛋白质沉淀下来，去除裂解液，再重溶蛋白质，再测浓度。各位有兴趣可以试试。或者自己配点试剂做做。

=======================================================

這個kit定量其實也不準確的, 因為最後測定的時候, 吸光度一直在變化
不過做比較還可以

作者: jingling845 时间: 2014-4-2 23:02

我想了解一些双向凝胶电泳技术的内容,有那些好的参考书籍,若知道,麻烦告诉一声,谢谢.

作者: ukonptp 时间: 2014-4-2 23:02

QUOTE:

原帖由 jingling845 于 2014-4-2 23:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想了解一些双向凝胶电泳技术的内容,有那些好的参考书籍,若知道,麻烦告诉一声,谢谢.

请参考双向电泳资料贴：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1698274&sty=1&tpg=2&age=0')

作者: ukonptp 时间: 2014-4-2 23:03

下面为你提供一些蛋白质组学研究方法的中文资料：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=2072850&sty=1&tpg=1&age=0')阿

作者: gogo 时间: 2014-4-2 23:03

分析软件2万美金啊,怎么能随便外借呢?
用一次2000美金还可以考虑!

作者: vvmmoy 时间: 2014-4-2 23:04

Proteomics is money consuming. Simple protein comparison can not yield too much useful information, but attract fundings or grants. Most of paper published only disclosure the differences on high abundance proteins, which may be the result of change not the root cause. A paper may claim 30-50 proteins difference, but non of them can be verified by biology.
Protein identification techniques are quite mature, especially MS part. The challenging part of proteomics is how to find differentially expressed proteins. If proteomics can not combined with genomics, the research is less useful, even useless. The instruments are very good, but the problem is that operators don't know research and researchers don't know what is the right tools to choose.

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)