分析测试百科

标题: 【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图 [打印本页]

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:38 标题: 【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图

我是新手。做了2个礼拜了吧，原来一直没有结果，我仔细分析了一下，找不出原因。上园子里广泛搜索，学到了不少东西。猜测可能是转膜时间太短，所以我今天新换了转膜液，延长了时间，今天总算有了吧。不过，对这个结果我很疑惑。图中m代表marker，s代表样品。marker最大位置在118处，下面是65。目的蛋白的分子量是92，santa的产品说明书上写的。从图中可以看到最亮的条带在118以上！！！如果说这条不是我所要的蛋白的话，那么这抗体也太差劲了吧，，，都抗到别的地方去了。如果是我要的，那这位置。。。。
我的参数是：5%浓缩胶，10%分离胶，总共恒压130v,2小时左右。转膜400mA，150分钟。常温5%牛奶封闭过夜，一抗（santa 羊抗鼠多抗）3小时，2抗（HRP标记）3小时。PVDF膜。试剂都是新的。
请大家帮助分析一下吧，谢谢啦。除位置问题帮助分析一下以外，还有什么做的不好的地方，也请一并指正！
国庆节都没法过咯。。。。-_-

图片附件: 66327140.jpg (2014-4-5 17:38, 8.53 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=23849

作者: zhezhe 时间: 2014-4-5 17:39

先搞清楚你的蛋白信息，看看有没有别的isoform,不同isoform的蛋白大小不一样，位置肯定也不一样。然后重复一下你的实验，看是否在同一位置出现带，如果可能，可以设阳性对照。

作者: finger 时间: 2014-4-5 17:39

先确定你的蛋白大小，才可把握转膜时间等。。。

作者: vtongli 时间: 2014-4-5 17:39

楼上说得没错,
另外, 会不会是多抗非特异性呢?
二抗是羊抗的吧?
抗体稀释浓度和转膜时间是关键,
但貌似你的问题不是出在这.
阳性对照最好做一做了.

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:40

可惜没有标准品

作者: xueyouzhang 时间: 2014-4-5 17:40

400mA 150min的转膜时间够长的
92kD的蛋白没有必要这么久
300mA 90min足够了
二抗没有必要那么长时间 1h就够顶多2h
Marker怎么会显影？

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:40

我也不明白marker怎么会显影。。。。@_@!
问了几个人说，偶尔是这样的，所以也没在意
昨天问了个牛人，他对这结果也没法解释。首先，电泳没问题，条带跑得很开。转膜也看不出问题，不管时间电压，转上去就行。最后，那三个显然是条带，绝非污染。难道问题在抗体上？？
前几次我用的是350mA，90min，总是不出结果，所以把条件调整了，而且把膜剪大了点，于是。。。。

作者: gemei0115 时间: 2014-4-5 17:41

个人认为这个结果不太可信.
1. 预染marker显影,这说明你的抗体孵育有问题.如果是室温的话,一抗和二抗时间都太长了.
2. 如果那条亮带是你的目的条带,我认为这个条带至少也在200kD左右了,根据我的经验一般来说分子量越大蛋白条带应该越细(除非表达量特别大的).而你的条带很粗很亮,看起来比较像没有跑开的蛋白条带,因此建议你将染胶图像和染膜的图像都发上来供参考.
建议:
1.重新跑两块胶,一块染胶,一块转膜,确定胶跑得没有问题,新配的试剂并不一定没有问题的,PH不对的,跑不下来的很多的.这一步相当重要,,不然后面一切都是白搭.
2.查询目的蛋白相关信息,不要放弃,说不定这是一个重大的科学发现呢!
希望lz反馈实验结果,以便进一步讨论,祝国庆快乐,实验顺利!

作者: youreyes 时间: 2014-4-5 17:42

marker分子量我不知道有没有问题
显影是正常的：有的公司专门开发了这样的产品，我用过的。

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:42

QUOTE:

原帖由 youreyes 于 2014-4-5 17:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

marker分子量我不知道有没有问题
显影是正常的：有的公司专门开发了这样的产品，我用过的。

高人！就按你说的做！明天恐怕要配一天的试剂了，有结果我一定贴上来！

作者: yyaxw84 时间: 2014-4-5 17:43

130v跑电泳,是不是有点大了,我们都是80v跑浓缩胶，100v跑分离胶.

作者: misswu61 时间: 2014-4-5 17:44

是不是蛋白煮的时间或温度不够，煮过的蛋白再跑最好65度5min

作者: 2541 时间: 2014-4-5 17:44

二抗时间过长了，缩减至30min

作者: 大海啊故乡 时间: 2014-4-5 17:45

130v跑电泳电压不高，如果pH值偏低，恐怕还要加大电压才能跑的快些。
楼主好象没有说是预染marker，所以可能显影，前面我说过。
有个最简单的办法：
转膜后用丽春红染膜。可以看到转膜的情况，然后洗去颜色，可以继续WB一张膜就够了

作者: Ao7 时间: 2014-4-5 17:45

个人建议：首先：SANTA的抗体很差劲，其特点就是广而不精，就是什么抗体都有，什么抗体都不好用！你最好换个其他厂家的抗体试试，Abcam、BD的都不错。其次：我以前用也遇到过这类情况，胶顶部总有很亮的非特异性带，有人说可能是蛋白二聚体，你可以查下你的目的蛋白是否有二聚体的形式存在，你可以在煮过蛋白后立即将样品放在冰上冷却，阻止蛋白聚合，我试过，但对我的目的蛋白效果不大，最后还是换了抗体才好。
lucky!

作者: huifeng0516 时间: 2014-4-5 17:45

10%的分离胶，92kD的蛋白按理应该就是在分离胶的上端啊。个人认为目的蛋白的位置没错，只是楼主把marker的大小弄错了而已

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:46

这么多弟兄参与讨论，真让我感动！！现在汇报一下情况，并对部分战友的回答进行解释。
这两天我又在另一个技术比较好的实验室请牛人做了一下，还是没有结果。在90kd处没有条带，反而在40处有两条。现在初步可以判定：要么是我样品制备有问题要么是一抗有问题。至于图中出现的三条带，应该不是我要的，我也不知道是什么，后来做也没有出现过了。
关于样品制备我觉得没什么难的啊！我的步骤如下：从-80度冰箱取出肺组织，常温解冻，称量，按照公司购买的蛋白裂解液说明书要求，100mg组织加1ml液体，后进行匀浆操作。后12000转离心30min，取上清保存并测量浓度，还蛮高的。再后来就是按照4：1的比例加入loading buffer，将水烧开，丢进去5分钟，取出迅速置于冰上。
我就是这么制备样品的，各位看看有问题吗？？难道是解冻那一步？我觉得这样没什么吧，其它的我就找不出原因了。

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:47

多少伏跑电泳我觉得不是很关键的问题，因为我的电泳液是重复利用的，所以我这个电压是不断的在改变的。事实上，各实验室的所使用的电压也都不一样，能跑出来且好看就行！

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:48

你说的这个煮过的蛋白再跑最好65度5min 是什么意思？我一般煮过的用不完的样品我都放在-80度了。下次解冻了直接用，没有再煮了。

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:48

130v跑电泳电压不高，如果pH值偏低，恐怕还要加大电压才能跑的快些。
楼主好象没有说是预染marker，所以可能显影，前面我说过。
有个最简单的办法：
转膜后用丽春红染膜。可以看到转膜的情况，然后洗去颜色，可以继续WB一张膜就够了
......

=============================================================================================================

我没有说清楚，不好意思，是预染的marker。转膜以后可以非常清楚的看到marker，并且正反面我都不用标记了，因为正面的marker颜色深，而膜反面的颜色浅。我也用丽春红染膜，也能看到条带，转膜是应该没问题。

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:48

QUOTE:

原帖由 Ao7 于 2014-4-5 17:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

个人建议：首先：SANTA的抗体很差劲，其特点就是广而不精，就是什么抗体都有，什么抗体都不好用！你最好换个其他厂家的抗体试试，Abcam、BD的都不错。其次：我以前用也遇到过这类情况，胶顶部总有很亮的非特异性带，有人说可能是蛋白二 ...

对了！我这里也有人说是蛋白二聚体！从位置上看差不多正好是2倍的样子。但是后来也觉得有点勉强：因为蛋白是煮过的，并且我保证操作没问题。还有啊，我跑的就是变性胶，应该不会“聚体”了吧。
你说对你的蛋白效果不大，你是什么蛋白阿？我是ACE2。看来你还是我的“前车”呢。ACE2有二聚体吗？

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 17:59

10%的分离胶，92kD的蛋白按理应该就是在分离胶的上端啊。个人认为目的蛋白的位置没错，只是楼主把marker的大小弄错了而已

===============================================================

呵呵，这个可能性不大。后来我用别的marker也跑过，我的marker的位置没错。

作者: wiwi 时间: 2014-4-5 17:59

我们提蛋白是把小组织块从液氮中取出直接加入液体研磨匀浆的

作者: caihong 时间: 2014-4-5 17:59

从蛋白条带的弯曲方向来看，你的分子量好象标错了,也就是说，你把蛋白分子量大小方向搞反了.你所标记的"?"区域是所有小分子量区域,10%胶不能分离20kD以下蛋白,也就是说你所指示的显色条带实际是"20kd"及其20kD以下的蛋白都跑在了一个band上了,存在非特异性条带就显色了.
最大分子量区域不可能有这么明亮的条带存在(大分子量转膜效率很低;跑电泳后大分子量蛋白丢失非常明显).

作者: vcve 时间: 2014-4-5 18:00

是不是蛋白煮的时间或温度不够，煮过的蛋白再跑最好65度5min

==============================================

我的意思是煮过的蛋白冻回去了，下次再跑前65度加热5min。
还有你说再做一次发现条带在40kd处，你的样品有没分装，我的经验蛋白最怕反复冻融，会不会降解了，分子量变小了。

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 18:01

从蛋白条带的弯曲方向来看，你的分子量好象标错了,也就是说，你把蛋白分子量大小方向搞反了.你所标记的"?"区域是所有小分子量区域,10%胶不能分离20kD以下蛋白,也就是说你所指示的显色条带实际是"20kd"及其20kD以下的蛋白都跑在了一个band上了,存在非特异性条带就显色了.
最大分子量区域不可能有这么明亮的条带存在(大分子量转膜效率很低;跑电泳后大分子量蛋白丢失非常明显).

===============================================================================================================

我没有标错，呵呵，很肯定。
“10%胶不能分离20kD以下蛋白,也就是说你所指示的显色条带实际是"20kd"及其20kD以下的蛋白都跑在了一个band上了,存在非特异性条带就显色了.”
你的意思是说20kD以下蛋白不在10%的胶中往下跑么？？所以才聚集在上面？

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 18:02

我们提蛋白是把小组织块从液氮中取出直接加入液体研磨匀浆的

========================================================================================================

我知道有人这样做。我现在很怀疑我先解冻是不是不对，所以才导致结果很糟糕！组织样品到底该怎么处理呢？很需要这方面的资料

作者: bluelake 时间: 2014-4-5 18:02

我们通常是把组织样品测完浓度后分别分装，放到-80保存，每次用时取一份。

作者: biabiade 时间: 2014-4-5 18:03

重复几次看看是否都一样，另外要考虑你所测蛋白丰度问题．

作者: 阿司匹林 时间: 2014-4-5 18:29

我知道有人这样做。我现在很怀疑我先解冻是不是不对，所以才导致结果很糟糕！组织样品到底该怎么处理呢？很需要这方面的资料

=========================================================================================

查阅相关的文献，最好是英文的，一般会有关于组织蛋白提取方法的，包括裂解液的配方什么的

作者: owanaka 时间: 2014-4-5 18:30

你的蛋白有修饰吗？看起来表达量最大的那个有200kda左右，还有后来你换一个实验室做的时候这条条带有没有出来？最好把你后面做的有代表性的图像发上来，我怀疑是样品处理和封闭的问题。

作者: tudou85 时间: 2014-4-5 18:31

同意楼上的！！
我的预实验就很郁闷，上样量200ug才有好的结果。所以，丰度绝对是个问题。
还有，蛋白提取时，要加蛋白酶抑制剂的，这个错误我犯过

作者: greenbee 时间: 2014-4-5 18:32

我个人的经验是蛋白质提取好测好浓度后迅速分装，每次就拿出来一管一管的用，融化后用不完的样品扔掉，决不要再用，蛋白质冻融后降解很快。不要考验一下蛋白质的抗降解能力。
另外，做WB之前多去看看文献，查准提取蛋白的方法以及选用抗体的品牌，型号等等，不要在这些方面花时间。开始做WB的时候就不要再去反复的搞这些，都是不应该浪费的精力。
其次，在初次做WB时，多做考马斯染胶和染膜，确定蛋白质跑胶转膜良好再去杂交显影，不要等到显影后再发现有问题，浪费钱老板要骂的。
其实做WB并不难，就只怕你考虑不周就开始做。步骤很多，每一步都要确保稳定可靠再进行下一步。个人意见，供参考。

作者: 惊醒ing 时间: 2014-4-5 18:33

我个人的经验是蛋白质提取好测好浓度后迅速分装，每次就拿出来一管一管的用，融化后用不完的样品扔掉，决不要再用，蛋白质冻融后降解很快。不要考验一下蛋白质的抗降解能力。
另外，做WB之前多去看看文献，查准提取蛋白的方法以及选用抗体的品牌，型号等等，不要在这些方面花时间。开始做WB的时候就不要再去反复的搞这些，都是不应该浪费的精力。
其次，在初次做WB时，多做考马斯染胶和染膜，确定蛋白质跑胶转膜良好再去杂交显影，不要等到显影后再发现有问题，浪费钱老板要骂的。
其实做WB并不难，就只怕你考虑不周就开始做。步骤很多，每一步都要确保稳定可靠再进行下一步。个人意见，供参考。
......

===================================================================================

说的是啊！！如果是现在的我做，肯定和刚开始不一样，没办法，吃一堑长一智吧！！
你提供的样品保存方法不错！以后就照着你的做。
楼上几位兄弟提到了丰度的问题。我测过的，感觉还是蛮丰的，呵呵。
我昨天又取了新鲜的心脏（原来是肺），这次可是什么都新鲜了，明天看结果。如果还不行，换抗体！！！

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)