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标题: 【分享】生命科学领域中的成像术 [打印本页]

作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:07 标题: 【分享】生命科学领域中的成像术

说是成像术，其实就是拍照，从最常规的简单的EB染色，CBB染色，到荧光成像，化学发光，再到最危险的同位素成像等，原理都是差不多，即条带和背景之间信号的差异，只是过程和要求不同而已
从灵敏程度来划分
常规染色 ug-ng级
荧光 ng-pg级
化学发光 pg级
同位素 pg-fg级
做科研过程中，如果没有其他因素的限制，每人都希望检测灵敏度越高越好，这样真实程度也就越高，越不容易出现漏检的情况，能决定科研项目是否有必要进行下去的可能等等，所以我们开始就从同位素成像说起。
放射性同位素的特点
放射性同位素（radioisotope）是不稳定的，它会“变”, 这就是所谓“核衰变”。放射性同位素在进行核衰变的时候，可放射出α射线、 β射线、γ射线和电子俘获等。
核衰变的速度不受温度、压力、电磁场等外界条件的影响，也不受元素所处状态的影响，只和时间有关。放射性同位素衰变的快慢，通常用“半衰期”来表示。半衰期（half-life）即一定数量放射性同位素原子数目减少到其初始值一半时所需要的时间。
常用同位素的特征常数
同位素符号半衰期 β射线能量（MeV）
氢-3 3H 12.3年 0.018
碳- 14 14C 5720年 0.156
磷－32 32P 14.3天 1.71
硫－35 35 S 87.1天 0.167
碘－131 131I 8.05天 0.605
放射性强度及其度量单位
1Ci (居里)=3.7×1010dps　　　　
1uCi=每秒钟发生3万7千次衰变
射线与物质的相互作用
1兆电子伏在空气中射程阻挡物吸收效果
α射线 1.0厘米一张普通纸完全
β射线 10米有机玻璃板产生轫致辐射
γ射线 1千米铅不能被完全吸收
使底片感光；
使一些物质产生荧光；
可穿透一定厚度的物质，可能使一些物质的分子发生电离；
当射线辐照到人、动物和植物体时，会使生物体发生生理变化
同位素的优点
1、灵敏度高
－－－放射性示踪法可测到10-14－10-18克水平、Southern blot可达pg以内
2、测量方法简便易行
－－－X底片曝光、扫磷屏
3、能准确地定量、定位
－－－射线与物质含量呈线性关系
同位素示踪法基本原理：性质相同，可被跟踪
同位素示踪法特点：灵敏、简便、定量、定位
同位素示踪法在分子生物学中的应用：杂交、酶反应、蛋白DNA结合实验等。

作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:08

现在对于同位素成像，很少会用到胶片，而采用磷屏成像。相对于X胶片而言，磷屏具有更高的灵敏度，更宽的线性范围，污染小，可重复使用等优点

作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:08

磷屏是一个二维能量存储类型的感应器，在其可被光激发的磷（BaFX：Eu2+）层面上储存电离辐射。当已曝光的磷屏被红光二次激发后，电子进行跃迁，随后返回基态，发出400nm左右的蓝光，发光强度与储存的能量成正比，从而可以进行定量分析

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:09

磷屏可用于同位素检测、X射线检测、中子及其他能量物质的检测

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:09

一般磷屏的结构有三层，保护层（PET）、磷屏层和支持层（铁化合物和PET），而对于3H磷屏只有两层，即磷屏层和支持层，因为3H发射出的能量非常弱，不能穿透保护层，所以3H磷屏没有保护层，这种3H磷屏是一次使用的

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:10

磷屏成像原理

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:10

磷屏的使用过程

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:11

3H磷屏成像

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:11

32P成像

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:11

全身放射自显影

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:13

X射线晶体衍射

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:14

竹笋叶的自身射线

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:15

荧光成像
荧光成像是随着荧光染料的发现而不断发展。新型荧光染料的发现不仅推动了激光器的发展，同时在生命科学领域也推动了新技术、新的检测方法的发展。
荧光成像应用：
标记，定位, 成像，定量
荧光显微镜,
流式细胞仪,
DNA测序仪，
Real-time PCR
基因芯片
DIGE
FISH
活体成像
Fluorescent Dye （荧光染料） Excitation （ nm ） Emission （ nm ）
Cy2 TM 489 506
GFP(Red Shifted) 488 507
YO-PRO TM -1 491 509
YOYO TM -1 491 509
Calcein 494 517
FITC 494 518
FluorX TM 494 519
Alexa TM 488 490 520
Rhodamine 110 496 520
ABI,5-FAM 494 522
Oregon Green TM 500 503 522
Oregon Green TM 488 496 524
RlboGreen TM 500 525
Rhodamine Green TM 502 527
Rhodamine123 507 529
Magnesium Green TM 506 531
Calcium Green TM 506 533
TO-PRO TM -1 514 533
TOTO?-1 514 533
ABI,JOE 520 548
BODIPY?530/550 530 550
Dil 549 565
BODIPY?TMR 542 568
BODIPY?558/568 558 568
BODIPY?564/570 564 570
Cy3 TM 550 570
Alexa TM 546 555 570
TRITC 547 572
Magnesium Orange TM 550 575
Phycoerythrin,R & B 565 575
Rhodamine Phalloidin 550 575
Calcium Orange TM 549 576
Pyronin Y 555 580
Rhodamine B 555 580
ABI,TAMRA 560 582
Rhodamine Red TM 570 590
Cy3.5 TM 581 596
ABI,ROX 588 608
Calcium Crimson TM 590 615
Alexa TM 594 590 615
Texas Red? 595 615
Nile Red 549 628
YO-PRO TM -3 612 631
YOYO TM -3 612 631
R-Phycocyanin 618 642
C-Phycocyanin 620 648
TO-PRO TM -3 642 660
TOTO?-3 642 660
DiD DilC’(5) 644 665
Cy5 TM 649 670
Thiadicarbocyanine 651 671
Cy5.5 675 694
GFP蛋白：其吸收峰为λmax＝395nm和λmin＝470nm，发射峰为λ＝509nm。
转基因动物: Green mouse
外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监测外源基因的表达.
检测细胞能否表达某一基因: 将待测基因的启动子与GFP DNA 相连, 可实时监测细胞能否表达兴趣基因.
GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与GFP DNA 相连可实时监测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成

作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:20

开发出Cy2，Cy3，Cy5染料后，大大简化和推动了2D技术，为蛋白质组学的发展注入新的活力

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:20

光学成像技术种类繁多，但近年来以近红外线荧光成像技术的研究最为注目。当光波长为700-900nm近红外线区域，遇到荧光分子时发出不同波谱特点的信号，这种信号用发射滤栅分辨并用高敏感的CCD照相机获取图像。由于内源性生物光敏分子吸收少，而使光能穿透进入组织数厘米，这个深度已足够对所有的动物模型成像而不用借助于其他昂贵、复杂的成像技术。
近红外染色由于背景低，信噪比高，近年来发展非常迅速
AlexaFluor750成像

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:21

DY676染料小鼠体内成像

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作者: 831226 时间: 2014-4-14 15:24

医学影象学对于在生命科学的研究，其重要性是不言而喻。它能够为我们提供最直观，形象的生命信息。从“智能胶囊”到分子探针都是科研工作者把成象技术在生命科学中实际运用的典型例子。
“智能胶囊”如感冒清大小，能代替胃镜作检查，并可检查大肠、小肠。为消化科医生对小肠病变研究提供了很好研究工具。目前只有中国和以色列生产。“智能胶囊”是对人体内宏观病变的客观观察。我们可以进一步设想，我们还可以研究出用于人体的其他系统（比如心血管系统）的像“智能胶囊”一样的显微成象技术。
随着“人类基因组”计划的完成，对于蛋白质的研究成了科学家研究的热点和重点，而蛋白质的研究只有在活体生理条件下研究才能获得最直接真实的信息，而这个信息同样需要成象技术的运用。我们知道LZ提出的传统的Cy2，Cy3，Cy5等染料有很多特点：1光稳定性差，容易光漂白，2 发光强度不大，3生物相容性差，4光学特点上发射光谱宽，激发光谱窄，不能实现同一光源下多个荧光发光。基于以上几点决定了传统的荧光染料不能用于活体条件长时间多通道的实时动态的研究。
寻找一种能克服传统的荧光染料的荧光物质，能与一些单克隆抗体，多肽连接成能特异识别目标蛋白的分子探针，用相应的技术（电穿孔，引导蛋白等）把分子探针用到活细胞内，从而实现对生理活体条件下的蛋白的研究。
目前能够取代传统荧光染料的是半导体量子点（QD），它是一种纳米级的颗粒，有独特的光学特性，能克服传统的荧光染料的缺点。但是其运用很到程度上是在非活体条件取代传统荧光染料，对用于活体条件还鲜有报道，就其原因是：1 QD表面的生物修饰问题，要解决分子连接的问题，同时不影响QD的量子产率。2 生物相容性问题，对于量子点用与活体后其被代谢的整个过程还有大量的研究工作要做。3 被制备成分子探针后怎样引入细胞内和目的蛋白结合的问题。
对于成像技术在生命科学领域的运用，是一个不可能被取代的技术，希望这个贴子能引起更多人的关注，支持LZ。

作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:24

医学影象学对于在生命科学的研究，其重要性是不言而喻。它能够为我们提供最直观，形象的生命信息。从“智能胶囊”到分子探针都是科研工作者把成象技术在生命科学中实际运用的典型例子。
“智能胶囊”如感冒清大小，能代替胃镜作检查，并可检查大肠、小肠。为消化科医生对小肠病变研究提供了很好研究工具。目前只有中国和以色列生产。“智能胶囊”是对人体内宏观病变的客观观察。我们可以进一步设想，我们还可以研究出用于人体的其他系统（比如心血管系统）的像“智能胶囊”一样的显微成象技术。
随着“人类基因组”计划的完成，对于蛋白质的研究成了科学家研究的热点和重点，而蛋白质的研究只有在活体生理条件下研究才能获得最直接真实的信息，而这个信息同样需要成象技术的运用。我们知道LZ提出的传统的Cy2，Cy3，Cy5等染料有很多特点：1光稳定性差，容易光漂白，2 发光强度不大，3生物相容性差，4光学特点上发射光谱宽，激发光谱窄，不能实现同一光源下多个荧光发光。基于以上几点决定了传统的荧光染料不能用于活体条件长时间多通道的实时动态的研究。
寻找一种能克服传统的荧光染料的荧光物质，能与一些单克隆抗体，多肽连接成能特异识别目标蛋白的分子探针，用相应的技术（电穿孔，引导蛋白等）把分子探针用到活细胞内，从而实现对生理活体条件下的蛋白的研究。
目前能够取代传统荧光染料的是半导体量子点（QD），它是一种纳米级的颗粒，有独特的光学特性，能克服传统的荧光染料的缺点。但是其运用很到程度上是在非活体条件取代传统荧光染料，对用于活体条件还鲜有报道，就其原因是：1 QD表面的生物修饰问题，要解决分子连接的问题，同时不影响QD的量子产率。2 生物相容性问题，对于量子点用与活体后其被代谢的整个过程还有大量的研究工作要做。3 被制备成分子探针后怎样引入细胞内和目的蛋白结合的问题。
对于成像技术在生命科学领域的运用，是一个不可能被取代的技术，希望这个贴子能引起更多人的关注，支持LZ。
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谢谢多谢您的参与
你说的那些荧光染料的缺陷确实存在，后面我也会降到Qdot成像，但这是个新兴的领域，在生命科学领域应用的时间还不长，还没有荧光染料那些形成气候，但今后肯定是一个方向

作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:25

前面站友也说到了荧光染料的一些缺点：如1光稳定性差，容易光漂白，2 发光强度不大，3生物相容性差，4光学特点上发射光谱宽，激发光谱窄，不能实现同一光源下多个荧光发光。而现今发现的Qdot刚好能弥补这些不足，接下来会说到Qdot成像
量子点可作为生物探针是从1998年Alivisatos 和Nie两个研究小组开始，解决了如果将量子点溶于水溶液，以及在量子点表面偶联生物大分子的难题，此后量子点的功能进一步被发现、推广，使之成为生物学领域研究的热点。

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:25

量子点的结构

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:26

量子点的特点

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:27

量子点的特点

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:27

量子点的发光
量子点在同一波长激发下，根据颗粒大小不同而发出不同颜色的荧光，颗粒越小，发出荧光的波长越短

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:28

商业化的量子点标记的Streptavidin

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:28

上面下层一张图中有两种Qdot在同一激光下分别呈现红光和绿光，分别定位细胞核和细胞质中的蛋白

作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:28

量子点在western Blotting中的应用示意图

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:29

应用于生命科学成像中的量子点常用的交联方式

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:29

量子点与核酸探针交联后，用于基因芯片，同样的理论，量子点也可应用于蛋白芯片

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:29

在量子点的基因芯片或蛋白芯片中，只用一种激光就能获得所有的荧光数据，简化了成像分析过程，也简单了对分析仪器的要求

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:30

量子点标记活细胞，由于KB细胞膜上有叶酸受体，用量子点标记叶酸，由于叶酸与其受体相互作用，把量子点带到KB细胞表面，特异标记KB细胞

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:30

量子点标记癌细胞，在活体成像中的运用

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:30

相关疾病：
肿瘤肿瘤转移
量子点标记肿瘤，观察肿瘤转移

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:31

量子点将会是生命科学成像的标准方法

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作者: minran_1980 时间: 2014-4-14 15:31

这是个介绍QD的动画。

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