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标题: 【讨论帖】细胞蛋白电泳奇怪图形 [打印本页]

作者: guagua 时间: 2014-4-14 16:56 标题: 【讨论帖】细胞蛋白电泳奇怪图形

我刚做WB，现在先只做到电泳，然后考马斯亮蓝染色。请问大家跑全蛋白的话假如做的好的话应该是什么样子呢？我用的是10%的胶，蛋白浓度1.1mg/ml，每孔上了15微升的样，跑出来的蛋白几乎全集中在60——110KD之间，也分不出条带，只是一团，其他位置就没有多少蛋白了，这是怎么回事呢？

作者: guagua 时间: 2014-4-14 16:56

下图为原图，10％分离胶，左边两道是marker:分别为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4
后面六道是提取的全蛋白，2乘的上样缓，每孔共上15ul，蛋白浓度1.1mg/ml。
最后两道是蛋白样品不够了，放在四度冰箱里很久的BSA，居然跑出了条带！

图片附件: 65396792.snap.jpg (2014-4-14 16:56, 13.1 KB) / 该附件被下载次数 20
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=24001

作者: glass 时间: 2014-4-14 16:57

蛋白样品是如何处理的？估计和你的样品有关！

作者: guagua 时间: 2014-4-14 16:57

蛋白样品是如何处理的？估计和你的样品有关！
样品是购买的碧云天的成品裂解液，主要成分为20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate， β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin 。50ml的培养瓶加了300微升裂解液，冰上裂解30分钟。然后-80度保存。电泳前加入上样缓冲液后100度煮5分钟。

作者: glass 时间: 2014-4-14 16:58

上样前离心了么？

作者: guagua 时间: 2014-4-14 16:58 标题: 回复 #5 glass 的帖子

上样前没有离，但是提蛋白的时候离过了12000g 10分钟

作者: guagua 时间: 2014-4-14 16:58

我是一个人做WB的，没怎么看过别人做，都是从书上和园子里看来的方法。跑的好的全蛋白应该是什么样子的呢？

作者: glass 时间: 2014-4-14 16:59

1.是样品裂解后，离心12000g 10分钟取上清，然后冻存的么？如果是的话，应该可以，离心已经去掉细胞碎片等了。
2.你的样品上样时是否太粘了，如果太粘就不容易跑下去。适当稀释一下，再电泳看看。
3.按你的蛋白浓度，上样量不用这么大也可以，如果是1.0mm，10孔的小胶梳子，上10微升也不少了。

作者: guagua 时间: 2014-4-14 16:59

是离心之后取上清又-20度冻存的，做的是5ml的小胶，十孔的梳子。

作者: vcve 时间: 2014-4-14 16:59

上样缓冲液中是否有SDS,样品是否清亮?

作者: lxh031 时间: 2014-4-14 17:00

哈，这里很热闹啊，我也来凑个热闹
楼主比较一下你的图与下面的图有无相似之处，若有，那我再继续；若无，那我就无话可说了

图片附件: 36957394.snap.jpg (2014-4-14 17:00, 15.1 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=24002

作者: guagua 时间: 2014-4-14 17:00

楼主比较一下你的图与下面的图有无相似之处，若有，那我再继续；若无，那我就无话可说了
是的，中间没有跑开的部分跟我的一模一样啊

作者: guagua 时间: 2014-4-14 17:01

上样缓冲液中是否有SDS,样品是否清亮?
缓冲液中有SDS，是清亮的

作者: fei1226com 时间: 2014-4-14 17:05

为什么不在这里公开说说？？让大家都了解一下有好处嘛

作者: yapuyapu 时间: 2014-4-14 17:06

QUOTE:

原帖由 fei1226com 于 2014-4-14 17:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
为什么不在这里公开说说？？让大家都了解一下有好处嘛

原因有2
1 本次想借用楼主的典型例子，开展有奖读图分析活动，为本版首次尝试，欢迎大家畅谈己。
2 原因可能是多种多样的，我的观点也是猜测，在楼主进一步验证结果出来之前，还不能完全肯定。楼主已经同意验证，欢迎各位积极发表个人对本问题的看法。

作者: fsdd817 时间: 2014-4-14 17:09

电泳缓冲液的pH是多少？

作者: xyw5 时间: 2014-4-14 17:09

电泳缓冲液的pH是多少？
电泳缓冲液是很久以前配的，当时配的时候是调到8.3，10乘的储液，临用时稀释十倍，没有再测PH，估计应该没有大问题吧，因为marker跑的还行。

作者: gogo 时间: 2014-4-14 17:13

楼上最好还是把图片贴出来吧，这样更利于大家分析原因。
电泳缓冲液贮存液不需要调pH 的，配完了用时稀释到1乘，就是8.3。
你这个贮存液调到8.3，我觉得不对，稀释后pH会变了吧。
电泳时，pH很重要，无论是配胶的tris还是电泳缓冲液。

作者: duoduo 时间: 2014-4-14 17:14

我也是用的像楼主配的电泳缓冲液,先配好调好PH值,用的时候再稀释直接用,没有再进行调整PH值,我们的胶都跑开了啊,没有出现楼主的问题,所以我觉得原因应该不是这个吧
再说了,他的marker不是还跑的还行么,呵呵
我个人认为还是对你的样品用样品处理液处理的时候没有做好吧
我也是菜鸟,期待高手予以解决!

作者: redbutterfly 时间: 2014-4-14 17:14

上样缓冲液是配的还是买的，什么条件保存，有没有完全解冻混匀，吸取的量是否足够？最终上样是1*吗？
marker能跑好，说明胶没问题，如果不考虑蛋白制备问题的话，这个很值得考虑

作者: guagua 时间: 2014-4-14 17:15

上样缓冲液是配的还是买的，什么条件保存，有没有完全解冻混匀，吸取的量是否足够？最终上样是1*吗？
marker能跑好，说明胶没问题，如果不考虑蛋白制备问题的话，这个很值得考虑
上样缓冲液是在上海生工购买的，说明上让常温保存，我放在四度的，是2乘的，即和样品是一比一的关系。

作者: guagua 时间: 2014-4-14 17:15

电泳缓冲液贮存液不需要调pH 的，配完了用时稀释到1乘，就是8.3。
你这个贮存液调到8.3，我觉得不对，稀释后pH会变了吧。
电泳时，pH很重要，无论是配胶的tris还是电泳缓冲液。
电泳缓冲液配了很久了，记不太清了，当时好象就按照书上的配方配的，好象没测PH。今天临上样前测了一下，发现只有7.0。不知是不是这方面的问题。
今天打算跑胶的时候发现蛋白样品解冻后出现了沉淀（上次是清亮的），请问大家这是否说明蛋白样品有问题呢？

作者: gogo 时间: 2014-4-14 17:15

问题还是出在样品这一块，我曾经也出现过类似的情况．样品裂解后，离心12000g 10分钟取上清，应该可以已经去掉细胞碎片，如果切实如此，这个可以分析不是原因．电泳液我们实验室也是像ＬＺ那样存贮的，应该问题不大．
分析：１，样品中盐离子浓度过高及其他离子影响蛋白定量，因为我曾在用ＢＣＡ定量时，发现正常本应该由绿色变成紫色的竟变成兰色，导致定量不准，以至实际上样量远远超出你计算出来的，明显图中的蛋白量超过按你给出的蛋白浓度计算的量　
　　　２，脂类等杂质也会影响定量的，注意吸取上清时避免吸到粘状的物质（取组织时最好不要取有脂肪的部分）．
附我做过的考染图２幅：

图片附件: 99430747.jpg (2014-4-14 17:15, 20.94 KB) / 该附件被下载次数 23
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=24003

作者: gogo 时间: 2014-4-14 17:16

上面附件另一张图：

图片附件: 65902426.jpg (2014-4-14 17:16, 20.75 KB) / 该附件被下载次数 26
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=24004

作者: fei1226com 时间: 2014-4-14 17:16

感觉还是样品的问题吧！

作者: fei1226com 时间: 2014-4-14 17:16

很赞同gogo额分析。本帖认为缓冲液什么的应该不是主要问题，应该是和样品本身特别是蛋白含量有关系，1mg/ml的BSA上样15ul跑page后条带也很粗，很多基因工程菌全蛋白跑电泳，目的蛋白表达的特别多也会出现某处蛋白条带很浓的现象。

作者: babybabe 时间: 2014-4-14 17:17

在没有看到图之前，很多的分析也只是猜测。
今天看到图后的第一感觉，也主要是样品的问题，不像是胶或缓冲液的问题。
1.上样量过大。像FHC说的，定量不准也是一方面原因，不过，不同的定量方法的干扰物质也不同，定量前应该根据样品中的成分选择合适的方法。
2.有可能样品裂解不充分。细胞内的蛋白成分很复杂的，楼主的图在35KD以下都没有什清晰的条带了，也可能是胶浓度低，所以分辨不清。不知道楼主的目的蛋白多大？
楼主先减少上样量试一下吧

作者: zhenxin 时间: 2014-4-14 17:17

不知道楼主的全蛋白是什么来源,细胞分泌上清?菌体/细胞裂解?还是其他什么方法提取的蛋白?
假设样品处理没什么问题,那这样的结果只能说楼主的蛋白样品里主要就2类蛋白为主,一个是60-110kd之间那种,一个是最下面那个带.上样量都偏大很多,建议样品稀释10-50倍后再跑一次
看BSA跑的似乎还可以,买来的所谓的99%纯度的BSA,变性胶跑出来就这副德行,带很杂,可能是重组的BSA的聚合体或者变性后降解成小片段,或者本身BSA就不纯.
个人感觉,不是样品里有不溶物质的原因,如果有不溶或者说难溶物质,那跑出来的结果应该是和FHC同学的第一图一样,从加样孔到浓缩胶到分离胶都有明显的蛋白纵向拖曳痕迹,或者样品里含有盐酸胍也会跑的乱七八糟,做过全菌电泳的都应该知道.
看楼主的图,60-110kd的蛋白已经跑离这个加样孔和浓缩胶,只是上样蛋白量太大,蛋白分子量又差不多,所才形成这么大一团条带.
建议再跑一次吧,把现有的样品从1:10:50:100这样稀释做一下,再跑试试看,样品跑之前,2x loading buffer闻闻看,有没有2-ME(2-巯基乙醇)的臭味,有的话,那这个loading应该也没什么问题,100度水浴加热5-7分钟,时间和温度要充足,,然后离心一下取上清上样.应该没什么问题

作者: guagua 时间: 2014-4-14 17:17

非常感谢各位前辈、战友的热心帮助！
我在这里把我做的样品以及处理方法说一下。
我提的是小鼠成纤维细胞V79的全蛋白，是未做过任何的正常细胞。我的目的蛋白是HSP70，不过现在单跑电泳就这副德性，所以还没有考虑目的蛋白的问题。
我用的是碧云天的成品裂解液，说明上的成分为：20mM Tris(pH 7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，以及sodium pyrophosphate，β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin ， 12000g 5分钟离心之后取上清-20度保存。并用BCA法测蛋白浓度，也是成品试剂盒。

作者: bamboo16 时间: 2014-4-14 17:21

个人认为样品提取时离心速度不够，可以尝试增加离心速度和延长离心时间来提取上清。也可能是样品低温冻存条件引起样品沉淀，建议先将样品与上样缓冲液混匀加热变性后贮存更好。

作者: tuuu2 时间: 2014-4-14 17:29

个人感觉还是样品得问题，MARKER得条带清晰，说明胶没有问题，主要还是样品浓度偏高。

作者: laughing妹 时间: 2014-4-14 17:30

个人认为样品提取时离心速度不够，可以尝试增加离心速度和延长离心时间来提取上清。也可能是样品低温冻存条件引起样品沉淀，建议先将样品与上样缓冲液混匀加热变性后贮存更好。
我昨天重新提了蛋白，15000g 10分钟，-20度保存，今天取出准备加样时发现又出现了沉淀。或许先将样品与上样缓冲液混匀加热变性后贮存比较可行吧，我下次试试看。

作者: laughing妹 时间: 2014-4-14 17:32

我感觉是样品的问题，我们实验室出过一次这样的情况，是样品提取的问题：样品比较粘稠，可能是因为取到脂肪组织，另外裂解液也不是很适用，后来是查文献自己配的裂解液，解决了这个问题
不知道我们的例子会不会对楼主有帮助
我的样品并不粘稠，因为提取的不是组织蛋白，所以不会有脂肪。不过也有可能是裂解液不适用，所以蛋白老会沉淀析出。
非常感谢以上所有前辈、战友的热心帮助

作者: fsdd817 时间: 2014-4-14 17:33

我来说两句，
我看了你的电泳图，Mark116-35的条带在胶上只占了大约1/3的距离，你提的是全蛋白吧，大部分蛋白应该集中在这个区域，太大和太小分子量的蛋白在你所提的蛋白中只占较小的部分，从你的Marker 看分离胶似乎高于15%个人感觉。你可以试一下12%的胶，在胶充分凝聚后再跑，在电泳时可以把最后一条Marker 跑到底，使你的蛋白充分分离。
同时我觉得电泳条件可能也有问题，你可以试试恒压浓缩胶80v，分离胶150v。
样品上样量可能也是高了，再做一块上5，10微升试一下。
试完想着再发个图上来研究一下，我觉得主要还是电泳条件和凝胶浓度方面的问题。呵呵！祝好运！！！！

作者: wmp1234 时间: 2014-4-14 17:35

个人感觉,一是样品浓度太大,二就是离心不够彻底

作者: BOSS2011 时间: 2014-4-14 17:36

总蛋白量大约15微克，并不多，我跑过很多胶，上100的时候都有，但没有这样的问题，应该还是样品处理的问题吧。不知道你有没有在提蛋白的时候，在加入裂解液后超声呢，这样可以充分的破碎细胞。

作者: 98776langtao 时间: 2014-4-14 17:37

战友验证图已出，大家可以就验证图发表看法，以便战友继续改进。根据图的结果我个人认为：大体方向是基本找到了（或者否定了一些方向，肯定了一些方向），但具体原因仍不清楚。
验证方法为：针对蛋白浓度过大和胶分辨率不佳，重新提取蛋白，分离较由10％改为8％，新旧一起由原来的15ul改为3、6、12ul梯度上样。
发现问题为：新旧蛋白解冻后都出现白色沉淀。
说明：1～7道marker分别为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4kd。

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作者: 98776langtao 时间: 2014-4-14 17:39

战友验证的BSA图。
我是第一次看到BSA的电泳图。
注：1～7道marker分别为116，66.2，45，35，25，18.4，14.4kd。
BSA，分子量66 210，由581个氨基酸组成．含17个双硫桥．分子长141A，半径4lA，等电点4．9．是从牛血清中分离的一种球状蛋白质，具有多个疏水结合点。

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作者: daod 时间: 2014-4-14 17:40

发现问题为：新旧蛋白解冻后都出现白色沉淀。

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出现白色沉淀可能是蛋白降解了啊

作者: laughing妹 时间: 2014-4-14 17:50

QUOTE:

原帖由 daod 于 2014-4-14 17:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
发现问题为：新旧蛋白解冻后都出现白色沉淀。

==============================

出现白色沉淀可能是蛋白降解了啊

是啊，找不出是什么原因。放在-20度再取出就会有沉淀，如果一直放4度就不会

作者: XYZQ 时间: 2014-4-14 17:51

我老师教的方法：
菌液ＯＤ在0.5左右时，取1ml，1左右时取0.5ml菌液,离心，弃上清，50μl 水＋50μl　２*上样缓冲液.煮5min,高速离心，取上清上样10μl,13%的胶.
下图是15%的胶.

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作者: greenbee 时间: 2014-4-14 18:17

根据各位战友的分析，本人认为这种情况的出现带是样品的问题，Mark和BSA没有问题，胶和电泳条件没有大问题，但我建议用低浓度胶跑，6%也行，减少上样量。蛋白的提取，程序没有问题，但裂解液值得商榷，建议换用分子克隆上的普通的三去污。蛋白-20后有沉淀，如果肯定了离心的效果，那么就有可能和裂解液的成分有关。
你要的全蛋白的图，我这个是肝组织的，10%的胶！

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作者: laughing妹 时间: 2014-4-14 18:18

谢谢楼上的建议和全蛋白图，我也认为该换一下裂解液试试

作者: cwcwcww 时间: 2014-4-14 18:18

一、培养细胞提取物蛋白电泳相对都比较容易点;
二、注意实验室蛋白污染(最底下的浓蛋白条带,我估计不是全蛋白成分,而是手或手套上的杂质);
三、没进行过除DNA/RNA的过程(加核酸酶或sonication处理),DNA/RNA睹塞电泳道;
四、离心强度和时间对于你的样品感觉还不到火候,离心速度越高越好,时间一般最好大于15min(我一般30000g,离心30min);
五、上样缓冲液改用DTT(现加)试试看,beta-ME太臭了;
总之,你的问题是在样品处理上.

作者: moonlight45 时间: 2014-4-14 18:20

建议离心20000g80min

作者: jujuba 时间: 2014-4-14 18:21

你提的蛋白进行过浓缩吗？如果浓缩，请问用什么浓缩的？

作者: laughing妹 时间: 2014-4-14 18:23

战友建议的离心速度越来越来高了，我目前用过最强的是26000g 30分，不过好象也没什么用啊。

作者: laughing妹 时间: 2014-4-14 18:24

你提的蛋白进行过浓缩吗？如果浓缩，请问用什么浓缩的
我没有进行浓缩，就是离心了一下然后取上清的

作者: xyw5 时间: 2014-4-14 18:24

本人刚开始学习跑SDS，看了上面各位战友的精彩讨论，确实获益匪浅，现有一个问题想向各位战友请教：我的目的蛋白分子量是6kD，用15%的分离胶试过，这种小分子量的蛋白质和溴酚兰条带分不开，随后我又改为20%的分离胶试了一下，但这部分蛋白质很分散，条带不集中，因此无法与marker比较（marker范围：66-4.1kD），另外marker最下面的两条带也看不清楚（6.5和4.1这两条）；
电泳条件是70V、4~5h，也试过浓缩胶和分离胶用不同电压跑，但结果也不理想；此外我过后测了一下Tris-HcL的PH值，结果为7.6左右，比实际要求的8.8 要小，估计错误或不当之处很多，还请跑过小分子量蛋白质的战友不吝赐教，衷心感谢您的帮助！

作者: remonte 时间: 2014-4-14 18:26

我以前好像也染过这样的胶，估计情况差不多，蛋白太浓了的原因吧，建议稍上点蛋白，或者稍稀释下！

作者: PINK 时间: 2014-4-14 18:26

我跑的电泳图,怎么有的条带(3/4带)会弯曲呐?
电泳方向是正确的(手机拍照),第1、3、4带同为未知蛋白溶液,2带为蛋白marker.
怎么会歪歪扭扭的呐？

作者: shenkunjie 时间: 2014-4-14 18:28

楼主的情况我也遇到过，很相似！分析原因：问题应该不是出在胶和电泳的条件上，因为Marker跑得很好！同正如楼上几位战友所言，主要还是考虑上样量太大。但单单从楼主计算的上样量来看，上样量应该不大，平时我都加20-30ug，楼主仅加了15ug左右，所以可能还是楼主的蛋白定量有问题。可以尝试用梯度稀释来摸索加样量。（其实平时我师兄做Western都不定量，而是通过做预实验看内参表达来判断和决定加样量。）
我们实验室平时细胞提蛋白的程序是：加冰PBS洗三遍，然后加RIPA全蛋白裂解液300ul，冰上裂解10min，然后15000转4度离心15min，然后直接取上清（留10ul用Bradford比色法定量），按5：1加6*loading buffer直接煮沸5min，然后-20度保存。效果不错，楼主可以一试！

作者: ending 时间: 2014-4-14 18:28

个人感觉你胶浓度不像10％的，像15％的，而且你的BSA怎么没有主带呀％我们的下层胶PH值是8.8，上层是6.8。

作者: sunnyB 时间: 2014-4-14 18:30

我觉得你要充分保证每个孔里都是一样多的样品。缓冲液要PH在8.3 这个非常有必要，在清洗玻璃板的时候最后一次一定用超纯净水去冲洗干净防止离子的干扰。基层胶电压不能超过90V，蛋白浓度过大容易形成拖尾现象，再者要保证配胶的各种试剂是好用的，过硫酸铵超过两周就不能用了，就降解了，最好少量配制，平时不用时吧所有跑电泳的有关试剂放4度。请多指教

作者: JK.jon 时间: 2014-4-14 18:30

同意楼上的观点。上样前离心很重要。我做蛋白电泳时离心时间短了都不行。

作者: youyou99 时间: 2014-4-14 18:30

个人认为在上样缓冲液中或样品中另外加几微升１ＭＤＴＴ　，离心要充分．

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