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标题: 【求助】丽春红染NC膜,染SDS-PAGE胶都无效 [打印本页]

作者: junjie05 时间: 2014-4-16 11:00 标题: 【求助】丽春红染NC膜,染SDS-PAGE胶都无效

配方试过两种
0.1g丽春红溶于5ml乙酸，加入重蒸水定容至100ml。
0.2g丽春红，3gTCA 3g磺基水杨酸，定容至100ml
请高手救命

作者: zhenxin 时间: 2014-4-16 11:02

染胶我没试过，但染膜绝对没问题！

作者: mamamiya 时间: 2014-4-16 11:03

我用的是第一种方案，染膜1-5分钟就行，另外你要注意一下膜的正反面，正面往往比反面明显的多。

作者: junjie05 时间: 2014-4-16 11:03

试过好几次了，然不上啊，奇怪

作者: junhun 时间: 2014-4-16 11:03

那要是染不上的话说明你的蛋白没有转上或者转过了．而且转过的可能性大．染胶用的是考马斯亮兰Ｒ２５０，如果胶上没有膜上也没有就是转过了

作者: junjie05 时间: 2014-4-16 11:04

可是我做WB做出来了啊，我是做出来以后才去染色的

作者: bling 时间: 2014-4-16 11:04

QUOTE:

原帖由 junjie05 于 2014-4-16 11:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可是我做WB做出来了啊，我是做出来以后才去染色的

WB做出来后，还怎么能染膜呢？
膜没有条带，是不是一片红啊？因为你已经封闭过的膜，上面都是蛋白了，丽春红再去染色怎能区分目的条带？
封闭原理：占位效应，封闭液（牛奶或BSA）的蛋白结合膜上的未与目的蛋白结合的区域，否则抗体（也是蛋白）会和膜上的其它部位结合的，封闭可以减少非特异性的着色。
所以染膜是在电转之后，封闭之前作的，只要短时间浸泡，双蒸水漂洗几次后再做封闭即可，不影响后面的试验。
染胶没有，是因为胶上的蛋白已经转到膜上了，所以胶上也没有了。
你看看是不是这个原因，祝你一切顺利！

作者: junjie05 时间: 2014-4-16 11:04

感谢老师的帮忙
请问一下，如果我用普通MARKER和NC膜做WB的话，要用什么方法显示MARKER条带
PS:我染胶是电泳后直接染的，时间是10MIn
再请问一下，为什么WB后用考染（PVDF），又能显示条带，难道考不会和封闭液结合吗

作者: bling 时间: 2014-4-16 11:06

1.普通的Maker显色，一个方法是染胶（考马斯），一个方法是染膜（丽春红），显示MAKER，尤其是染膜后，用铅笔可以做一下标记，再脱色。
还可以买预染MARKER。
2.你是分两块胶跑的PAGE么？我一般是同时跑两块胶，一块用来专门考马斯染色，一块是转膜用。考马斯染后的胶再做免疫印迹不是很好，可能会影响转膜后的与抗体杂交反应，所以不推荐转膜前将胶做考染。
3.“考染（PVDF）”你是指用考马斯染的PVDF膜么？一般都是用考马斯染胶，用丽春红染膜。我没有试过用考马斯染的膜，更没有做过考马斯染WB后的膜，不知道别人这样做过没有。反正我曾经试过把WB之后的膜用丽春红染色，一片红，啥也没有，和封闭有很大关系。

作者: junjie05 时间: 2014-4-16 11:06

我现在的WB操作是这样的
电泳，半干转，封闭（脱脂奶粉），一抗，洗膜，二抗，洗膜，显影，考染PVDF膜，定位MARKER
效果很好
可是使用NC膜，用相同的方法，用丽春红染膜染不出来（因为NC膜用考染脱不了色）
还有我做了两次电泳后直接丽春红染胶液染不出来（分别使用一、二配方）
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考马斯染后的胶不能直接接着做免疫印迹了吧。
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所以我才打算试一下丽春红染胶在脱色，在转膜
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3.“考染（PVDF）”你是指用考马斯染的PVDF膜么？
======================
是的

作者: bling 时间: 2014-4-16 11:07

还是按常规的方法来把：
1.考马斯染胶；丽春红染膜。
2.转膜后封闭前，丽春红短暂染膜（<1min），蒸馏水洗脱，定位MAKER。
3.考马斯染转膜后的胶，看看有没有残留蛋白。

作者: junjie05 时间: 2014-4-16 11:07

谢谢
建议如果做PVDF膜的话可以试一下显影后直接考染定位MARKER，效果很不错的

作者: glass 时间: 2014-4-16 11:07

丽春红染不上的话可以考虑加10%甲醇再试试

作者: bling 时间: 2014-4-16 11:08

封闭之后的PVDF膜还可以用考马斯亮兰或立春红染出蛋白条带么？为什么呀？

作者: fox_79 时间: 2014-4-16 11:08

封闭之后应该就染不出条带来了，而是整张膜都红（兰）了，牛奶或BSA也应该能染上，不过如果蛋白量大的话没准能看出来？

作者: junjie05 时间: 2014-4-16 11:09

QUOTE:

原帖由 bling 于 2014-4-16 11:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

封闭之后的PVDF膜还可以用考马斯亮兰或立春红染出蛋白条带么？为什么呀？

封闭后丽春红是染不出来，考马斯亮蓝是完全可以的
原因我也觉得很郁闷

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