分析测试百科

标题: 【求助】让师姐也挠头的提不出蛋白的问题 [打印本页]

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 11:09 标题: 【求助】让师姐也挠头的提不出蛋白的问题

各位前辈高手请指点：
前天，中午11点30杀的大鼠，取脑，人工脑脊液浸泡，4度冰箱保存，下午4点拿普利莱公司的蛋白裂解液做的蛋白提取，以水为对照，电脑测定蛋白含量为— 5.67。（同期，师姐拿新鲜的脑提组织得结果为41。）
考虑是当时冰上裂解时间不够，今天又做了一次，结果基本相同：— 4.65。
问题分析：
1、脑组织不新鲜？？——师姐说虽然组织死掉了，但里面怎么样也该有蛋白呀。
2、保存问题？？——4度条件下，蛋白分解了？？
3、裂解液问题？？——师姐和我几乎同时做的，用的同一瓶裂解液（可提包浆蛋白、核蛋白、膜蛋白），她提出的蛋白测得含量为41。
4、蛋白酶抑制剂问题？？——第一次用的蛋白酶抑制剂确实是有点问题，应该拿异丙醇溶，我用水溶的。我也发现了这一问题，第二次换了另一公司的，经查询确实也是用异丙醇溶，买新的异丙醇溶的。而且根据我查到的资料，蛋白酶抑制剂应该影响不大，很多时候不用都可以提出来。试剂公司的也证实，很多公司生产的蛋白酶抑制剂纯度都不好，加上意义并不大。
5、匀浆问题？？——冰上操作的，时间是匀10分钟，冰上置20分钟裂解。（第一次匀完就离心了，师姐就是那样做的，并没有花时间冰上裂解，一样提出来了）
6、离心问题？？——4度，12000转，5分钟，取上清。
什么问题？？——想破脑袋了。

作者: yjf1026 时间: 2014-4-16 11:26

"电脑测定"是什么意思？你再看看是紫外测定还是考马斯亮蓝测定。
由于你的值是负的，如果用的是考马斯亮蓝测定的话，我想可能你们的蛋白质裂解液里面，或是人工脑脊液里面混入了一些干扰考马斯亮蓝显色的物质。可以检查一下人工脑脊液还有去公司“质问” 一下！

作者: yjf1026 时间: 2014-4-16 11:27

跑个胶看看吧

作者: abc816 时间: 2014-4-16 11:27

电脑测定蛋白含量为— 5.67

===============================================================================================================

即使蛋白有降解或提取过程中有些小问题蛋白也不会测定为负值，你的测量仪可能没有调好，我们实验室曾经有人用波长490（应该为595，加G250)测蛋白浓度出现了负值，后改回来后就正常了，你可检查一下你的染液和所调的吸收光波长是否相符。

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 11:28

谢谢各位前辈指点，万分感激！！！
我的解释：
“电脑测定”是指我们实验中心有一台全自动蛋白含量测定仪，只需2微升样品滴进测定孔中，1分钟出结果，全自动电脑操作的。紫外测定和考马斯亮蓝测定我还真都没有做过。
我记得那个测定系统可以选择，测蛋白、测PCR或者其他什么，波长什么的是提前就预设好的，并不需要自己调。而且第一次测时，师姐和我几乎同时做的，她的都测出来有41，我的却是负值。
汇报我第三次提的情况：
头两次提组织中的蛋白，我都用的以前的组织，我和师姐分析会不会是组织不新鲜造成的（从杀到提中间过了五个小时，只是一直在冰上放着），昨天周五（2007年6月15日）我又新杀了一只大鼠，拿新鲜脑组织提了一遍，结果仍旧为负值—3.54。师姐跟我开玩笑，说我每次都有进步。我说再提四十次，就会达到30以上的高水平了。
后来下午找到另一位博士师姐，她的意见是：
1、很奇怪，她从来没有碰到过。
2、总蛋白应该很好提，她经常提核蛋白，最低是5，从来没有说是负值的情况。
3、建议我跑个胶看看。
4、因为我和师姐当时用的同样的裂解液，基本可以排除裂解液的问题。
5、因为我和师姐当时用的是不同的蛋白酶抑制剂，建议我拿我师姐的蛋白酶抑制剂试一次。
6、可以让我师姐拿我的东东做一遍，来排除是否试剂的问题还是人为的问题。
综上所述：结合各位前辈的指点，我想下周再做以下尝试：
1、跟师姐商量（注：她不是我亲师姐），是否可以用她的蛋白酶抑制剂，是否可以请她帮忙操作一次。
2、再做一次，分别用新鲜和不新鲜组织提取，完成后测定（我们的测定是老师操作的，我再向他查证下波长的问题（谢谢wgqsdams））测定如果仍为负值，跑胶，用考马斯染下看（谢谢neuronboy和zebrafishtom ）。
思考：
我今天忽然想到一个问题，我是每50mg组织用1ml裂解液，是不是量太大了我查的有关资料是100~150mg组织用1ml裂解液，我有个同学查的资料上是50mg组织用0.2毫升（她还没提过），但我想就算是我用量太多？（但我师姐她们就用这么大量），也不至于产生相反的作用，导致提不出来吧？？
祝各位前辈事事顺利！

作者: bamboo16 时间: 2014-4-16 11:28

你的组织保存液确定没有问题么？我对这个不是太懂，不过你和师姐的差别之一就是这个，值得考虑一下。
另外，裂解液多加应该问题不大的。最多浓度降低。你要是担心的话，降低一半的量试试喽。
另外可以把匀浆裂解的时间延长一点试试看。
你用的是什么蛋白酶抑制剂？

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 11:29

你的组织保存液确定没有问题么？
另外，裂解液多加应该问题不大的。
你用的是什么蛋白酶抑制剂？

==========================================================================================

请问您指的组织保存液的问题是什么？？蛋白酶污染？？我用的是自配的人工脑脊液。对，我刚好用完了，下次重新配。
裂解液的问题，试剂公司也是这样的看法。
我用的蛋白酶抑制剂是PMSF（苯甲基磺酰氟）分子量174.19

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 11:33

晕倒了^
那个上次用我裂解剂的师姐今天又要提蛋白了,我请求她再用我的裂解液试一次,结果她做出来结果不错是19.3。我全程跟踪。基本可以排除裂解液问题，可以排除测试仪问题，同时发现一个重要问题，我匀浆时间很久5——10分钟，她只匀十几下，肉眼看不到组织即停止。置冰上时间也仅5分钟左右（她甚至在实验过程中没有看过表）——当然她主要是为了摸其他的条件，所以她自己也说这次操作不是很严格（所以测出的结果没有上次好。注：上次41.多）

作者: avi317 时间: 2014-4-16 14:42

你们是提核蛋白么？
裂解液用的什么？
浓度可以达到这么高么
怎么我提处理浓度很低很低？
我也遇到过负值的情况
后来发现是我的标准曲线没有做好的原因
重新做了标准曲线浓度就好点了
但是仍然很低
不知道如何提高核蛋白浓度
我还要提线粒体蛋白
浓度一样很低
真折磨人

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 14:42

你们是提核蛋白么？
裂解液用的什么？
浓度可以达到这么高么
怎么我提处理浓度很低很低？
我也遇到过负值的情况
后来发现是我的标准曲线没有做好的原因
重新做了标准曲线浓度就好点了
但是仍然很低
不知道如何提高核蛋白浓度
我还要提线粒体蛋白
浓度一样很低
真折磨人
......

============================================================================================================

我提蛋白用的是普利莱公司的RIPA（裂解液），我师姐用来提膜蛋白，我目前是提总蛋白练练手，RIPA我们这里都比较推荐百*泰*克公司的，我刚学做实验不懂就给买“错”了，不过这个用起来还不错吧，我师姐做了两次，第一次41多，第二次她连称都没称就估了个重量配的液还19多，她的同学送她的比较贵的另一个（好象还是进口货）与我给她的这个同时提的两次一次是20多，一次才3多。当然你可不要被我误导了，总的来说试剂中大多进口的产品比较稳定，出结果又快又好。
核蛋白我也不会提，听说是不好提的。不过我师姐提膜蛋白好象是要变速离心的，你再问下别人吧，核蛋白我有另一个博士师姐提过，她是用试剂盒提的（注：她们博士比我们硕士有钱）。
今天我又请师姐拿我的裂解液RIPA提，我全程观摩。师姐的结果比较理想。可基本排除掉裂解液的问题和检测仪的问题。师姐与我的不同处在于：
1、她的裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂先混匀，然后倒入匀浆器匀。我是分别倒入的。
2、我们用的蛋白酶抑制剂不同。
3、她匀浆时间比较短，只十几下吧，我是5~10分钟。冰上裂解时间也比她长，我是10~20分钟，她是5分钟左右（而且她还没看表，估的）
我明天打算第四次提啦，做一组分别倒入的，做一组裂解时间和师姐一样短的，再做一组不裂解直接离心30min的，如果再不行……我已经让好几个同学在实验室楼下等我了

作者: ero11 时间: 2014-4-16 14:43

1)4度保存组织肯定不行,我们一般要在-80度保存.
2)允浆过程不能离开冰,时间关系不大,我的蛋白因为要反复离心,一提就是一天,也没出过问题.离心机应预先调至4度,根据我的经验，不用留裂解时间，允浆后即离心即可
3)当然应该先把蛋白酶抑制剂先加到裂解液混匀，但是要注意有些蛋白酶抑制剂（如ＰＭＳＦ）加到水里面一段时间后就会失效，因此不能加的过早
４）尽管加入了蛋白酶抑制剂，也一定要注意温度，如果忽略了这些细节，蛋白很可能会降解掉
５）不知你测蛋白时的标准曲线怎样，和你师姐的一样吗，这可是很重要的

作者: yjf1026 时间: 2014-4-16 14:46

1。匀浆十分钟，时间确实有点长，建议改成10秒/次，4-6次，4度冰浴。
2。你提的是核蛋白么？那么12000g离心后，细胞核应该是在沉淀中，你去上清，得到是胞浆总蛋白。
3。建议你将组织保存在-80度或液氮。

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 14:46

唉呀，万分感谢zhb_31和DIGE！！！
1、收到，我以后的需要保存的组织一定保存在-70度冰箱或液氮（注：我们这里没-80的冰箱）
2、我提的是总蛋白。
3、我决定今天把匀浆时间大大缩短。绝不超过30秒。
4、过程中的温度问题我一直都注意，不会忘的。包括离心机和匀浆器。整个过程一定是冰浴。离心机也是预调的。
5、标准曲线和师姐的一样，这个可以肯定。
6、很奇怪，我买的蛋白酶抑制剂是用异丙醇溶的，不知道对蛋白是不是会有影响？？？
再次感谢！！

作者: summerxx 时间: 2014-4-16 14:46

呵呵，问题好像差不多解决了。
你的匀浆时间似乎是长了点
裂解液应该是混好抑制剂之后再用的

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 14:48

胜利！！！——今天第四次提蛋白终于取得了成功！！！第一管测得27.32，第二管测得18.43。
汇报一下今天提的情况：
先说明一下，我昨天本来打算用三种不同的程序来考验看是哪个环节导致的问题，结果今早的意外情况导致我只做了其中两组——今天我一早赶到实验室，本来说好的，师姐一早到，拿她在—70度冰箱冻的样品给我用（她昨天提的就用的这一批样品），结果师姐因其他事晚了，而且她临时要杀一只大鼠。我当时看师姐没按说好的时间来，就正在配其他液体，结果师姐突然出现了，告诉我她的一个小师妹正要取大鼠心脏内的血（而且已经麻倒了），取完后这只要死的就归我——新鲜样本呀，求之不得！！！我当然要了，也因此以下准备工作没做：
1、看到一个帖子说PMSF（苯甲基磺酰氟）（注：固体）配前可以放置常温下贮存，但配好后（注：液体）就必须放到—20度冰箱冷藏。而我今天用的是上周五配好分装后置于常温下的。（原打算今早配新鲜的）
2、离心机没有提前制冷。抽空预冷后，放样品时才发现，离心机的离心盘不知被谁拿走了……晕死。还好另找了一个离心机，但没有时间预冷了。
做了两组：
1组：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF倒入匀浆器中，匀浆10秒/次，4次，冰上裂解5分钟，4度离心，12000转，5分钟。结果——27.32
2组：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF倒入匀浆器中，匀浆12下（各位，确实是12下，没有写错），不在冰上裂解，直接4度离心，12000转，30分钟。结果——18.43
经验总结：其实和楼上站友分析得一模一样——我认为最主要是裂解时间以前过长了。当然，提前没有混匀RIPA和PMSF而是分别注入匀浆器这一操作也在怀疑之列，我这两天再提一次，专门针对这两个环节做几组。得了结果，再向大家汇报。

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 14:48

今天上午又提了两组。
1组：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF倒入匀浆器中，匀浆5分钟，冰上裂解5分钟，4度，12000转，15分钟离心。
2组：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF倒入匀浆器中，匀浆10分钟，冰上裂解10分钟，4度，12000转，5分钟离心。
结果：1组：25.87
2组：26.11

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 14:48

总结：
1、提不出来蛋白的最大可能：裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF没有提前混好。
2、思考：匀浆时间不要过长，肉眼看不到固体组织即可；冰上裂解时间可以不要，但加上效果可能更好——5分钟即可；至于离心时间，30分钟差些，师姐那次提出41的是离了10分钟，从我做的情况来看，5分钟与15分钟似乎差别不大。初步怀疑是正态曲线分布，但考虑样本不一致的问题，不能定论，待以后有机会继续观察。
3、自己认为比较可靠的操作：提前混好裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF——注入匀浆器——匀浆至看不到固体组织（约2分钟）——冰上裂解5分钟——4度，12000转，离心10分钟——取上清。
考虑到时间与金钱的问题，很抱歉不能再专门针对这一情况继续纠缠下去了，在此谢谢网上、下所有关心并给予建议的朋友们！！！

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 14:49

上周末有个机会，提了四个，结果又把我搞晕了，情况汇报如下：
所有操作均为冰上匀浆约2~3分钟，无冰上裂解时间，4度，12000转，离心均为10分钟。
第一组：提前混匀RIPA和PMSF——结果18.54，纯度0.73
第二组：分别加入RIPA和PMSF，不吹打或振荡（不提前混匀）————————结果18.67，纯度0.71；
第三组：只加RIPA，且加大组织重量（减少RIPA使用浓度），不加PMSF——————结果43.31，纯度0.91；
第四组：用-20度冰箱保存的组织，将PIPA和另一种PMSF提前混匀————-——结果是—5.83
注：前三组是新鲜提取，但因实验室中午—80度冰箱室和测蛋白室都锁门了，没办法，只好把提的东西和组织一起放在—20度冰箱了。下午来时，突发奇想又做了第四组，一并测的蛋白含量。
看来是否提前匀好RIPA和PMSF，不加PMSF都不是关键。组织是否保存完善值得怀疑。RIPA的使用量似可调低些。新换的PMSF的质量也有待考查。

作者: wu11998866 时间: 2014-4-16 14:50

对了，前些天跑了个胶，贴出来让大家看看吧。不是很清楚，算是前期工作结果的展示和汇报吧——右数第三道（前两道是别人的）是MARKER，从右数第四道开始，逐道蛋白每孔依次分别为（单位微克）10、20、40、70、180（为了解最佳浓度上样量）对了，最后一道是180加样时漏出去的，师姐看过说那一道相比较而言最漂亮，我差点气晕过去……

图片附件: 99357488.jpg (2014-4-16 14:50, 18.63 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=24037

作者: avi317 时间: 2014-4-16 14:51

1.可能主要原因是烈解时间过长，蛋白质降解或变性。
2.离心时间和转速，有时要用高速离心机，10k，30min
3.自动分析仪有时样品少，可能有误差，不行就直接电泳，直观。

作者: 喵咪 时间: 2014-4-16 14:51

看了楼主的帖子，我想说两句：
1.试验中所用的标本一定要标准可靠
2.所用的试剂可靠，\5可靠，不行就扔，所用试剂最好自己亲手配制。
3.操作可靠，我发现楼主试验中很多步骤或者是叙述都是很凌乱
4.人可靠（有严谨的科学谨慎），做实验条理要清晰。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)