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标题: 【讨论贴】蛋白质大生产，欢迎群友参与～～～ [打印本页]

作者: yapuyapu 时间: 2014-4-19 16:53 标题: 【讨论贴】蛋白质大生产，欢迎群友参与～～～

看了许多帖子，大家大多是谈的实验操作问题，很少涉及大生产的问题，不像其他板块。其实目前蛋白质大生产前景看好，许多蛋白质表现出很好的生理药理活性，如何使这些蛋白质转化为生产力，为社会，为大家，为自己，带来经济效益，也有社会效益，一举几的？
蛋白质药物，要走出实验室应该说是我们的责任和义务。建议大家不要拘泥于瓶瓶罐罐。即便是瓶瓶罐罐，也要想着能不能工业化。说的大一点为了振兴民族工业，说的小一点为了自己的钱途。

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 16:54

[url]
论坛上很多人都很擅长于蛋白质的纯化，但是大家很少涉及与对于一个实验室的纯化方法是否可以放大成可行的纯化工艺，应用于生产，或者要求更高的话适合于GMP的种种验证。
正如GE公司所言：精心筹备的技术转化基础上建立起平稳、顺利的放大程序，将保证产品质量，节约整体成本，及时获得市场认可。
在这里我们可以举个例子说明工艺设计的重要性：例如：我们在纯化前处理时常常选择反复冻融（-20度）来破碎细胞（一般为几十毫升以下的样品），但是如果是在生产中处理几百升样品，等待样品溶化的时间成本以及在溶化过程中蛋白损失就是不可预计的，所以这种工艺是不适合放大的
例如：现在很多人使用protein A作为亲和层析配基，而在GMP中必须验证protein A的脱落是否对你的产品质量造成影响，如果你的产品是药，是否会引起病人的其它方面的副作用
现阶段正在研究纯化的工艺放大，想与在座的同志一起探讨一下：纯化工艺的放大[/url]

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 16:55

首先介绍一下
工艺卫生的重要性：
Cleaning in place（CIP）：Test 100’s of cycles at small scale
目的：为了降低可能产生有害物质的产品的污染；延长凝胶的使用寿命，减少重装柱的次数
•  预防步骤
•  在位清洗（CIP）
•  在位消毒（SIP）
•  在位消毒 [SIP] 的目的是将微生物感染减到最低，绝大多数的微生物可用0.5-1M NaOH以该凝胶的建议流速洗约0.5-1小时消除。在位清洗 [CIP] 的目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。凝胶在使用十次以后，最少做一次CIP。事实上，做CIP 时，往往已经包含了SIP，不必再重复。
•  生物活性物质的灭活
在位清洗（CIP）
•  可以避免污染物进入下一个步骤
•  延长层析柱的使用寿命
•  减少重新装柱的次数
•  每3-10循环后至少做一次CIP
•  最好使用倒流的方式

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 16:55

首先：工艺设计考虑的因素包括：
•  原料的性质:蛋白，血浆，疫苗等
•  蛋白稳定性
•  产品特性
•  纯化的策略
•  过程优化（重要和不重要的参数）
•  可放大性和工艺稳定性
•  环境
•  专利
•  经济成本
•  文件和可行性计划
•  质量保证：分析方法和过程控制
在这里：哪些会影响产品稳定性？包括：蛋白浓度、游离蛋白、温度、促溶剂、pH、蛋白酶、辅助因子、Buffer组成
层析树脂的选择
•使用预装柱进行筛选：技术支持，可放大性，稳定供货，在NaOH中的稳定性
•选择有相应的检测方法的层析介质：载量，装柱，寿命，可重复性（验证三批连续批号的胶）这里考虑介质产家最好是能够提高符合GMP验证文件要求的产家，可以稳定供货

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 16:56

对于层析参数的线性放大的一般原则是：
一般从小试到生产固定的参数是：相同线性流速、相同缓冲液、相同填料、相同柱高、相同的样品浓度和pH，相同的样品体积和柱床体积比例，相同梯度体积和柱床体积比例
放大的条件是：柱直径、体积流速，上样流速、上样体积、梯度体积

作者: owanaka 时间: 2014-4-19 16:56

我说说我的了解吧。
我现在的公司就是中试规模的纯化生产，我自己也在制造部工作，从自己从事生产的体会感觉到以下几点可能是纯化工艺从实验室进入生产最为关键的：
1.工艺的稳定性。工艺稳定是必须的，因为如果从事的是药物生产，你工艺的稳定性是新药申报时很重要的一个看点。工艺不稳定，那么申报时不可能成功，而且在以后的生产过程的批记录里，每步的产量或产率都存在上下限，工艺不稳定的话，呵呵，经常要写偏差报告。
2.纯化工艺的成本。老板们都是资本家，原则上成本越低越好。所以纯化时的填料啊、试剂啊什么的越便宜越好。比如层析，能用DEAE 就不用Ni-NTA，试剂如果能用国产的就不用进口的。
3.纯化工艺的策略。就像大家都知道的一样，即使你的工艺很稳定，每步都有95%以上的收率，那么连续5步后是多少呢？77%左右，所以如何尽量减少纯化的步骤也是很重要的。
以上愚见，抛砖引玉喽，呵呵

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 16:56

呵呵，谢谢楼上的见解
其实还有一点也很重要：就是在确定生产参数，必须是生产中可以接受的操作范围，例如缓冲液的pH，是不是非要7.4，7.3和7.2是不是也可以阿，因为在生产中大规模的缓冲液配制往往做不到特别的精确，因此在研发过程中必须要验证一个操作范围，在这个范围内纯化工艺都是可以做到。
例如以下参数范围是我们可以做的

图片附件: 62642587.jpg (2014-4-19 16:57, 56.11 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=24095

作者: remenb 时间: 2014-4-19 16:57

是啊，一般来说生产过程中的溶液pH不会像实验规模那样容易控制。我觉得你做验证的范围可以是7.2~7.4，但是生产时的记录最好是这样控制：7.3+-0.05。这样在实际操作中用pH计完全可以做得到，而且你实际应用窄范围，验证宽范围也更符合GMP的要求。

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 16:57

对于载量的确定，你们是如何具体操作的？
我总感觉我们现在的方法不太科学

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 16:58

在纯化放大时，常常涉及到一些基本的计算：
• Packed bed volume (L) = Column bed height (cm) * crosssectional area (cm2) * x10-3
• Settled chromatography medium volume (L) = Packed bed volume (L) * compression factor
• Slurry volume (L) = Settled chromatography medium volume (L) / (slurry concentration (%) * x*10-2)
因为我们现在用的是GE的介质，所以给大家推荐一个网站，计算就特别方便了
cuturl('http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp01396.nsf/Content/industrial_support~industrial_calculator~media_requirement')

图片附件: 27227480.jpg (2014-4-19 16:58, 79.91 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=24096

作者: remenb 时间: 2014-4-19 16:58

您所说的层析用填料的载量吗？
自己来确定填料载量的确很麻烦，我们用的多得是买来的QIAGEN的Ni-NTA，它应该有载量验证文件，但我的确没有想过这个问题，也没有看过相关文件。因为我们使用时就是根据它所标称的理论载量来计算所需填料体积的。根本没有想过做这方面的验证，在药监局的检查中也没有过异议。按理说Ni-NTA再生后是应该确定载量的，这里应该有个验证，但是的确没有做过。
顺便提一句，就我使用的经验来说，进口填料的标称理论载量都略小于填料实际的载量，也就是说实际上比说明书上写的要大一些。看来老外们做事很有分寸也很严谨啊。

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 16:58

是指填料的载量
确定载量，也是为了更好的节约成本，因为我们现在的产品附加值并不是特别高，而纯化往往也是成本最重要的部分
老外的确很严谨，曾经听别人说过，老外真的做CIP，用AKTAexplorer，做一百次，然后验证，感觉好奢侈哦，呵呵

作者: babybabe 时间: 2014-4-19 16:59

请问大生产纯化过程中Tris-Hcl缓冲体系，是不是不能用于制药报药方面。

作者: remenb 时间: 2014-4-19 16:59

Tris-HCl可以用于制药方面，但是最好要根据产品的性质确定是否可以用，因为Tris是多氨基化合物，你至少要保证你的产品不与之反应，并且所用试剂也最好不能与Tris有反应，否则就要有相关物质的检验方法才行。因为Tris是极为常用的缓冲体系，有时这一点就容易被忽略了。而且Tris体系成本要高于磷酸盐缓冲体系，成本也要考虑。
举个不恰当的例子，以前我上学时做酶的固定化，用酶的游离氨基与固定化载体的环氧基反应，但是就是忽略了Tris的反应能力，所以采用了Tris作为缓冲液。结果Tris 与载体反应了很多，酶都没有连接上。换了磷酸盐就好了：）

作者: lixi559 时间: 2014-4-19 16:59

Ni-NTA载量要看具体的蛋白,不同的蛋白吸附能力不一样,
纯化工艺设计按Capture, inetermediate purification,polish来设计,具体纯化时候Capture不一定用亲和,挂柱常用离子交换,楼上的举的例子是GE公司抗体药物纯化方法.

作者: lixi559 时间: 2014-4-19 16:59

用离子交换是由于参数容易控制PH,离子强度.疏水的参数就比较难控制,样品一变化就难挂上去.

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 17:00

QUOTE:

原帖由 lixi559 于 2014-4-19 16:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用离子交换是由于参数容易控制PH,离子强度.疏水的参数就比较难控制,样品一变化就难挂上去.

疏水层析pH：在pH5-8.5范围内疏水作用没有很大变化，pH<5.0疏水作用增加，pH>8.5疏水作用减弱
如果用上样高盐的buffer去处理样品，我做的大部分为破胞产物，所以在菌体复溶时就用上样buffer，大部分还是挺容易重复的，没遇见你所说的情况。能举例说一下吗？谢谢

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 17:00

同意，一般Capture都不会选择亲和，因为第一步的Capture毕竟杂蛋白还是比较多的

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Ni-NTA载量要看具体的蛋白,不同的蛋白吸附能力不一样,
纯化工艺设计按Capture, inetermediate purification,polish来设计,具体纯化时候Capture不一定用亲和,挂柱常用离子交换,楼上的举的例子是GE公司抗体药物纯化方法.

图片附件: 33491689.jpg (2014-4-19 17:00, 76.97 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=24097

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 17:01

在研发设计过程中，其实经过预装柱对填料的初选后，就要进行一些初步的计算，因为前面我们也说了：对于层析参数的线性放大的一般原则是：
一般从小试到生产固定的参数是：相同线性流速、相同缓冲液、相同填料、相同柱高、相同的样品浓度和pH，相同的样品体积和柱床体积比例，相同梯度体积和柱床体积比例
放大的条件是：柱直径、体积流速，上样流速、上样体积、梯度体积
所以在小规模必须估计你装多高的填料，放大以后使用什么样的柱子能满足你的生产要求

作者: zsxan1990 时间: 2014-4-19 17:01

最近也在做蛋白纯化，感觉步骤挺繁琐，而且丢失也比较多，特别是用层析柱的方法，最后得率往往都很低，仅做实验用的蛋白有时候就要做好几次，很费时费力，再大量制备运用到实际（如临床）估计更难。所以，我也同大家一样，觉得纯化工艺要放大！还希望大家多多指教：）

作者: babybabe 时间: 2014-4-19 17:02

在AKTA CLUB 交流时有人遇到这问题,具体目标蛋白记不得了,疏水结合的原理比离子交换复杂,不是很容易控制是正常的.
楼上建议你用大柱,不要小家子气一次做一点.

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 17:02

我不是很赞成楼上用大柱的观点，特别是用大的预装柱
主要是从经济性方面来说这个问题吧，因为大柱子会涉及到用到很多的填料，如摸索纯化条件的时候，你往往不会用足柱子的载量，但是一般作几次循环之后你肯定要做CIP，柱子是有寿命的，做一般我们认为用的比较好的话100次CIP后你的填料也差不多了，那么实际上你是浪费了很多填料，而且在摸索过程中，大柱子以为你用更多的buffer，更多的样品，制备出来的产品也不一定合格。
一般我现在是采取三步进行放大：
1.首先用1~5ml的预装柱进行填料的初步筛选——在这里你必须确定你选用何种填料介质，大致的纯化工艺是什么（梯度洗脱？线形洗脱？每个梯度几个CV）
2.中试验证，计算你生产的处理量，如我上面所提到的计算方法，计算你想用的柱子（假如是BPSS400/200），填装的高度（假如20cm），那么我可以选用XK50的柱子装填20cm进行中试验证，就是根据你小试确定条件进行优化
3.生产，用BPSS400/200，填装的高度20cm，根据中试结果进行优化

图片附件: 16111203.jpg (2014-4-19 17:02, 56.71 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=24098

作者: daod 时间: 2014-4-19 17:02

我做的蛋白纯化也是要达到制药级标准，即纯度在95%以上。我按照GE的说明书进行纯化，增长了不少知识，推荐大家到GE的网站下handbook或protocols，很有帮助：）

作者: moonlight45 时间: 2014-4-19 17:03

蛋白质的提取纯化的确很麻烦，正在做一蛋白，要求4度低温，用羧甲基-琼脂糖凝胶层析分离。这个条件实验室还是可以的，工业化生产可行吗？
尤其是羧甲基-琼脂糖凝胶是很贵的。
不知道各位，怎么对待这个问题的。
一般用什么柱子来分离？

作者: remenb 时间: 2014-4-19 17:03

实验室可以买个层析柜来保持4度的温度，但是生产时肯定不好处理。如果是药品的话，车间温度4度的低温车间好像没听说过，空调能耗太大了，如果用大的层析柜，那一个层析柜的验证也要烦死了。
至于凝胶是不是能用，这个可以做个小试，看看多少批次后凝胶的分离效果不能满足要求。然后核算一下。一般做高附加值产品的，基本上成本的大头不在层析填料上。其实再贵的填料只要生产商在生产，那肯定是有人用，只是你的产品附加值够不够了。呵呵，共同讨论吧

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 17:03

我们现在是安装了一个向超市里面（放酸奶的）的4度的柜子，可以关门，隔成好几个区域，可以分别开关温控，人手进去操作就可以，如果是低温车间主要是人长期操作受不了
至于凝胶能不能用，赞成remenb观点

作者: remenb 时间: 2014-4-19 17:04

想必斑竹作的不是药吧，不然你的冷柜肯定要有一个验证。比如，你的冷柜内的温度分布，是否能在4度的显示温度下达到4度；长时间运行冷柜内温度分布是否会有变化；冷柜的清洁与消毒是否可以满足操作要求......估计一大本验证文件，呵呵，很烦啊。如果各位战友作的是药品的话，建议哪怕多花点钱也要买个有验证文件的设备（尤其是关键设备），以后会省不少事。

作者: remenb 时间: 2014-4-19 17:06

恩，我不是做药的，所以对验证要求不是很严格

作者: coolcool 时间: 2014-4-19 17:10

验证真的很重要，而且相当繁琐！有很多制药公司在能用的情况下都省略了验证这一步，到了出问题的时候再想办法解决。有时候是得不偿失。

作者: yapuyapu 时间: 2014-4-19 17:11

我看到了，只是放大而已，离大生产还很远。

作者: kuaizige 时间: 2014-4-19 17:12

就我个人了解国内的蛋白生产大多还是比较常规的离子交换和凝胶过滤,无论是规模还是技术都不算很高,只有一些新的品种用到了疏水和亲和,那规模也不算大的,而只有疫苗纯化规模比较大,亲和的使用也越来越广泛,由于效率高,所以并不需要特别大的规模,而成本也很高,我知道有的药厂很有钱,但是让他们用10升亲和填料,只能用有限的次数,那也是难接受的,但是我个人觉得亲和将会用的越来越广泛,因为毕竟这样效率更高,而且成本未必会比普通的工艺高,这只是个时间问题,总之国内的蛋白生产无论规模和技术和国外还是有不少差距的.其实讨论这样的题目是比较大而且空的,因为不同的产品差别很大,不很好说.

作者: yapuyapu 时间: 2014-4-19 17:13

可以具体一点的讨论：
比如：温度怎么控制。离子交换常用什么树脂？
希望大家畅所欲言。

作者: wood533 时间: 2014-4-19 17:13

我看到了，只是放大而已，离大生产还很远。

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其实你不大了解他们中有一个就是专门做大规模蛋白工业化生产的，而且是非常著名的公司。
主要是通过发酵、复性得到可溶蛋白。
具体的我不是特别清楚。

作者: pengke1983 时间: 2014-4-19 17:14

对于不同的样品温度控制是不一样的,我在药厂的时候如果大多都是在层析柜中做的,因为柱子大,分离时间长了,自然需要留意温度,在大点的药厂也有专门的冷库.至于填料还是用琼脂糖凝胶类的离子交换填料多,因为流速好,生物兼容性好,回收率也高,而且价格不算贵,别的我见到的很少.工厂生产考虑的问题是和研发不一样,但是大多工厂都选择是成熟转让的工艺,自己很少去开发或改进工艺.
工艺大多是秘密,所以一旦开始中试或者已经是有前景的药物,都是机密,因此是不会在这里讨论大规模生产的情况的,所以也只能是讨论实验阶段的多

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 17:15

我看到了，只是放大而已，离大生产还很远

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“在求助前，先受人以鱼”，刚才看到这句话感觉很好，既然黑狐兄很迫切的想启发该话题，首先应该说说你的观点吧，大家才能更好的参与讨论
我不是做蛋白质药物的大生产的，我现在所在的蛋白质生产的放大与只是在我们所要生产范围内的放大。
我接触过几位做蛋白药物的国内厂家，有幸和他们交流时他们说，他们现在所用的层析柱已经是1m的直径了，在他们使用初期很多问题解决不了，后来是请了一位国外的纯化专家，人家的理论实践很好，花了很少的时间和金钱就解决了他们的问题。
其实我刚刚从研发开始往生产转，我肯定是没有太高的发言权，但是我总体感觉蛋白质生产究竟要怎么“大”法，还是必须看你的目的吧？而且每一步的规模肯定也是不同的，你是捕获阶段，还是中度纯化，还是精制？不能光是追求规模，而浪费填料，因为毕竟纯化是限制很多蛋白质产品的最终要的成本步骤。
蛋白质产品的附加值肯定也是你选择纯化方式的重要因素，太便宜的产品用好多步骤地层析肯定是不经济的
也总在一些发酵论坛上逛游，总体感觉生产工艺这个东西就是秘密，交流起来真的很有障碍。
所以如果真的要讨论，希望黑狐兄也拿出诚意来

作者: yapuyapu 时间: 2014-4-19 17:15

其实我认为大生产和试验验阶段的区别在于：
1：温度的控制。蛋白质的提取或精制一般要求4C的，但是大生产可以吗？如何跨过这个障碍？
2：层析柱问题，目前来说层析柱是最常用的的分离手段了，可是一般价格太高，比如凝胶层析，工厂里一般很少用这个东西的。不像中药成份的分离，大孔树脂就可以了。怎么解决？
我想这是两个限制步骤吧？---------------------抛砖引玉。

作者: xue258 时间: 2014-4-19 17:16

1,需要冷库或者层析柜,或者可以用水循环.
2.做一些贵的生物制品不用层析是不可能的,所以对药而言,填料是贵,但是没办法不用,10几升到几十升的凝胶柱子,甚至100多升的离子柱也是有的,并不少见.

作者: remenb 时间: 2014-4-19 17:16

其实我认为大生产和试验验阶段的区别在于：
1：温度的控制。蛋白质的提取或精制一般要求4C的，但是大生产可以吗？如何跨过这个障碍？
2：层析柱问题，目前来说层析柱是最常用的的分离手段了，可是一般价格太高，比如凝胶层析，工厂里一般很少用这个东西的。不像中药成份的分离，大孔树脂就可以了。怎么解决？
我想这是两个限制步骤吧？---------------------抛砖引玉。
......

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4度在生产过程中不好保证，建议在研发阶段如果可能的话，试试室温下可不可以完成，如果不可以的话，那最好用冷却水循环制冷，分别冷却层析柱夹套和层析缓冲液。冷库能耗高、人也受不了，没听说过整个各车间都是冷库的（咱也是孤陋寡闻的）。
至于层析柱填料，现在的生产中几十万RMB的填料是很多的，以前就见过一家公司，有几十台的AKTA Prime，几乎每台配一柱子，呵呵，填料大大的哦。至于黑狐兄说得解决方法，那就是找钱买吧，不用不行的。

作者: yapuyapu 时间: 2014-4-19 17:16

蛋白提取纯化实验室里经常用到离心，大生产也用离心？感觉不太现实。
不知道大家怎么看？

作者: remenb 时间: 2014-4-19 17:17

现在一般的生产企业实现固液分离，尤其是微小固形物的固液分离，很多还是离心。当然，对于实验室用的那种需要离心管的冷冻离心机用得很少，因为效率太低，处理量也不够，唯一的好处就是此种离心机的离心加速度较大。工业生产中的离心机大多是连续流离心机，处理量每小时都有上百升，对于一立方米左右的发酵规模足够用了，进口国产都有。如果发酵规模更大，那可以采用一些串联的过滤设备（如板框式过滤机等，先大孔径滤布，在小孔径滤布，几台串联使用）。不过一般使用过滤设备是，目的物都在溶液中。

作者: xyw5 时间: 2014-4-19 17:17

还有透析问题。
实验室里分离纯化蛋白好多提到超虑的方法，感觉大生产似乎不可行。

作者: pengke1983 时间: 2014-4-19 17:22

还有透析问题。
实验室里分离纯化蛋白好多提到超虑的方法，感觉大生产似乎不可行。

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 17:23

超滤有工业级的仪器，密理博就有，从试验室到生产的放大可以直接实现，而且我参观过一个做疫苗的老师试验室，他也有工业级规模的超滤，自己设计的一个装置，最主要的就是膜包和进口压力泵，不太复杂

作者: xue258 时间: 2014-4-19 17:23

透析呢？谢谢

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 17:24

现在一般的生产企业实现固液分离，尤其是微小固形物的固液分离，很多还是离心。当然，对于实验室用的那种需要离心管的冷冻离心机用得很少，因为效率太低，处理量也不够，唯一的好处就是此种离心机的离心加速度较大。工业生产中的离心机大多是连续流离心机，处理量每小时都有上百升，对于一立方米左右的发酵规模足够用了，进口国产都有。如果发酵规模更大，那可以采用一些串联的过滤设备（如板框式过滤机等，先大孔径滤布，在小孔径滤布，几台串联使用）。不过一般使用过滤设备是，目的物都在溶液中。

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你用过连续流离心机是哪家的呢？我们正在计划购买，不知道国产的质量怎么样？进口的是比较好，就是有点贵。
对于板框式过滤机，我原来也考虑要用这样的设备，可是这种设备好像一般的处理量都比较大，对于我现在规模做中试或者小试，好像买一套设备来太不现实了，可是不初步摸索条件之间上生产，心里突突，所以最后就放弃了。而且过滤对于高密度发酵产品来说，好像还是困难了些

作者: remenb 时间: 2014-4-19 17:24

你用过连续流离心机是哪家的呢？我们正在计划购买，不知道国产的质量怎么样？进口的是比较好，就是有点贵。

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CEPA 的质量就很好，德国公司的产品，处理量应该有几百升每小时，离心菌体没问题，如果离心蛋白什么的，最好询问一下厂家，看能不能达到离心加速度的要求。国产的动平衡做得不好，噪音狂大，用着都害怕。

作者: remenb 时间: 2014-4-19 17:25

透析呢？谢谢

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超滤系统最主要的作用就是浓缩和透析，可以看看塞多利斯的产品网站，他们的超滤系统可以根据你的处理要求进行设计，处理量可以达到上百升每小时，基本上工业化的浓缩及透析都可以满足要求了。
呵呵，帮他们做广告了：）

作者: ukonptp 时间: 2014-4-19 17:25

QUOTE:

原帖由 remenb 于 2014-4-19 17:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你用过连续流离心机是哪家的呢？我们正在计划购买，不知道国产的质量怎么样？进口的是比较好，就是有点贵。

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谢谢，我咨询一下
超滤系统的透析是等体积透析吗？我在实验室用过等体积透析，总体感觉不是很快，不知道工业中这种工艺可行性怎么样？使用的多吗？包涵体复性马可以用吗？

作者: yapuyapu 时间: 2014-4-19 17:25

讨论总结（希望大家继续交换观点）
1.国内的蛋白生产大多还是比较常规的离子交换和凝胶过滤
2.温度控制，在大点的药厂也有专门的冷库. 可以用水循环.
3.填料，琼脂糖凝胶类的离子交换填料多,因为流速好,生物兼容性好,回收率也高,而且价格不算贵,
4.离心，工业生产中的离心机大多是连续流离心机，处理量每小时都有上百升，对于一立方米左右的发酵规模足够用了，进口国产都有
5.超滤，超滤有工业级的仪器超滤系统最主要的作用就是浓缩和透析，可以看看塞多利斯的产品网站，他们的超滤系统可以根据你的处理要求进行设计，处理量可以达到上百升每小时

作者: wawa 时间: 2014-4-19 17:26

4度在生产过程中不好保证，建议在研发阶段如果可能的话，试试室温下可不可以完成，如果不可以的话，那最好用冷却水循环制冷，分别冷却层析柱夹套和层析缓冲液。冷库能耗高、人也受不了，没听说过整个各车间都是冷库的（咱也是孤陋寡闻的）。

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温度也是因蛋白而异，以我的经验，很多蛋白在室温下就可以纯化了，能控制温度更好，有利于蛋白的稳定性，很多时候室温下也不是不可以。因此如果一个研发的目的很明确：就是要工艺放大、做产品。那么研发的时候就应该考虑各种可能性，温度就是一个需要考量的重要参数。
比如流加培养CHO表达重组蛋白质，一般地发酵周期15~20days，37度。很明显可以看出，纯化过程中是否选用低温并不那么关键。
另外，除非是冻干制剂，如果终产品是液体制剂，4C的保质期一般应该在1
年以上吧？那么不严格的推论一下（25C变性速率常数是4C的10倍左右），室温下应该可以稳定30天吧。纯化应该用不了那么长时间。
当然具体情况具体分析，原则就是以小试的数据为基础。有些蛋白温度不同，色谱行为会发生不小的偏差，从而影响收率和产品质量。
如果一定要控温，色谱兄的方案应该可以满足大多数要求了。
大规模的透析难以操作，膜分离技术目前已经比较成熟，应该问题不大。
离心机还是不要考虑国产了，尤其是生产的设备，应该保证质量稳定，否则关键时候可能造成更大的损失，毕竟生物制品一般附加值较高。
中药成份做的不多，但大孔树脂一般还是粗分离，后面往往要配合高分辨率的反相层析以达到应有的分辨率，相比蛋白质的纯化，高压设备的投资和维护会增多，而且除Source反相填料外，一般的C18填料无法进行CIP，填料的寿命是个问题。相比之下，蛋白用层析填料（除亲和填料外），应该可以耐受几百次CIP和重复使用，成本哪个高哪个低还不好说。
凝胶过滤层析如果用于大规模的生产，柱体积还是太大了些，工艺研发的前期应该就日后预计的规模，提前选择合适的易于放大的生产工艺。

作者: yapuyapu 时间: 2014-4-19 17:26

大规模的透析难以操作，膜分离技术目前已经比较成熟，应该问题不大。
目前常用的膜分离技术有哪一些？最好是国产设备能做的。
因为从国情出发，一个是资金问题，另一个就是支持民族工业嘛。

作者: loli 时间: 2014-4-19 17:26

填料的寿命其实和样品以及维护有很大的关系,就填料本身的稳定性而言,一些小分子配基的亲和填料要是偶联用稳定的方法,重复上几百次以上也是没问题的,例如镍琼脂糖凝胶我一个朋友就曾经用了300来次,所以并非所有亲和填料的寿命就短,对于大分子的配基的亲和填料是寿命短点,但是那也和活化偶联的方法有很大关系,同样的抑肽酶配基如果选择NHS或者CNBr活化的偶联，１０多次后载量就下降很明显，很难工业化，但是如果改用更稳定的方法，那寿命就延长很多，个人觉得将来亲和和高分辨率的填料都会在纯化中大放异彩，其实凝胶柱子和离子交换相对处理量和效率来说我不觉得便宜，因为需要用更大的量，更长时间，更多步骤，而亲和有时候只需要１０％的填料就够了，尤其当越来越多蛋白的特性更清楚的时候，亲和往往会很好用，如现在抗体纯化大多会首先考虑亲和，因此大规模用亲和只是个时间问题．何况凝胶柱子其实是很难放大，费用很高，寿命也没想象的那么长，同样离子交换也是如此，因此并非常规的清洗就能使填料能恢复到和新的一样，好多年前我见工厂的ＤＥＡＥ填料用不了多久就得换新的，所以选择什么工艺还是需要综合考虑，做过对照才能有更好的结论．例如蛇毒中的凝血酶纯化不用亲和是根本做不到电泳单一条带的，就算勉强用常规的方法，那收率也很成问题．
正如白龙版主所言，并非都需要４度去纯化，对于一些不稳定的蛋白，亲和可以时间更短更快，这也是我看好亲和色谱并且花不少时间做活化和偶联以及填料表面处理的原因．

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