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标题: 【求助】2-D中两性电解质的问题，急 [打印本页]

作者: 11_hjx 时间: 2014-4-19 20:30 标题: 【求助】2-D中两性电解质的问题，急

1。我在提取组织的裂解液里已经加了2%的两性电解质，如果在水化液再加的话聚焦时电压就很难升到目标电压，一般只能升到一半，请问各位高手水化液不加两性电解质可以吗？样品中原有的两性电解质在聚焦时应该还会起作用的吧？
2。聚焦后胶条两端靠近电极处的几厘米会比中间薄很多，但是颜色没有变，这是什么原因呢？是烧焦了吗？谢谢大家！

作者: standbyme 时间: 2014-4-19 20:30

QUOTE:

原帖由 11_hjx 于 2014-4-19 20:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1。我在提取组织的裂解液里已经加了2%的两性电解质，如果在水化液再加的话聚焦时电压就很难升到目标电压，一般只能升到一半，请问各位高手水化液不加两性电解质可以吗？样品中原有的两性电解质在聚焦时应该还会起作用的吧？
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两性电解质的作用是形成连续的pH梯度，使蛋白在泳动到等电点时便停止。
　　合适的两性电解质浓度，会在聚焦初期的1-2个小时很快在胶条内形成pH梯度。如果两性电解质浓度低，形成的pH梯度不充分，会出现聚焦不完全的的结果。相反，两性电解质浓度过高，会使形成的pH梯度得时间延长，影响蛋白的聚焦，升压速度变慢的等等。
　　通常，2%的浓度已经是上限了。一般保证终浓度在0.5-2%的范围内。建议你可以试试1%，甚至更低的浓度。
　　此外，胶条中间厚，两端薄不是烧胶。而是你的蛋白和其他一些物质由聚焦前的均匀分布，变成聚焦后的定向分布。胶条两端一般没有蛋白和两性电解质等物质的聚集，因此略有些薄是合理的。但如果厚度不均的现象非常明显，就不正常了。
　　祝实验顺利。

作者: 11_hjx 时间: 2014-4-19 20:31

因为我的模型很难做，所有的模型都是按这个条件取材的，不可能重新再做了，还有两个问题想请教，你说的2％是w/v还是v/v呢？即使水化液不加两性电解质，原来样品中的两性电解质在聚焦的时候是不是也会起作用呢？非常感谢！！！

作者: wawa 时间: 2014-4-19 20:32

QUOTE:

原帖由 11_hjx 于 2014-4-19 20:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
因为我的模型很难做，所有的模型都是按这个条件取材的，不可能重新再做了，还有两个问题想请教，你说的2％是w/v还是v/v呢？即使水化液不加两性电解质，原来样品中的两性电解质在聚焦的时候是不是也会起作用呢？非常感谢！！！ ...

2％是v/v。而且是指上样总体积的0.5％-2％。
此外，原来样品中的两性电解质在聚焦的时候是会起作用，但问题在于，你的样品体积很小，而水化液的体积较大。当样品被水化液后，两性电解质的浓度大大降低，肯定远远小于2％了。

作者: 11_hjx 时间: 2014-4-19 20:32 标题: 回复 #4 wawa 的帖子

哦，那水化液再加点就可以了，十分感谢！！！

作者: fei1226com 时间: 2014-4-19 20:33

“两性电解质的作用是形成连续的pH梯度，使蛋白在泳动到等电点时便停止。
合适的两性电解质浓度，会在聚焦初期的1-2个小时很快在胶条内形成pH梯度。如果两性电解质浓度低，形成的pH梯度不充分，会出现聚焦不完全的的结果。相反，两性电解质浓度过高，会使形成的pH梯度得时间延长，影响蛋白的聚焦，升压速度变慢的等等。”
DIGE，恕我孤陋，第一次听说两性电解质还有这样的作用，可有出处？两性电解质是如何形成连续的PH梯度的呢？如果不加，等电聚焦是不是无法完成？那么我们的IPG胶条又起到什么作用呢，它不是固相化的PH梯度胶条吗，难道它必须借助两性电解质才能形成梯度？
我目前只知道两性电解质可以增加蛋白的溶解度，防止部分蛋白到达等电点后出现沉淀现象。
对你上述的回答有疑问，呵呵，望指点。

作者: chengjie79 时间: 2014-4-19 20:35

看情况而定,两性电解质一般有两种,一种是以Amersham为代表的IPG buffer,其使用浓度为0.5-2%,其中2%用于裂解使用,0.5%用于水化,另一种是以Bio-Rad为代表的Bio-lyte,其使用浓度为0.2-0.5%,其中0.5%用于裂解使用,0.2%用于水化.
在聚焦过程中，两性电解质其实不加也没问题,适量

作者: standbyme 时间: 2014-4-19 20:36

恕我孤陋，第一次听说两性电解质还有这样的作用，可有出处？两性电解质是如何形成连续的PH梯度的呢？如果不加，等电聚焦是不是无法完成？那么我们的IPG胶条又起到什么作用呢，它不是固相化的PH梯度胶条吗，难道它必须借助两性电解质才能形成梯度？
我目前只知道两性电解质可以增加蛋白的溶解度，防止部分蛋白到达等电点后出现沉淀现象。
对你上述的回答有疑问，呵呵，望指点。
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　　IEF（等电聚焦）电泳的关键技术就是形成连续的pH梯度。在固相pH胶条出现之前，一直是利用载体两性电解质形成稳定，连续的pH梯度。
1．载体两性电解质的历史：
　　载体两性电解质的概念始于1961年，由瑞典科学家Svensson首先提出的。
　　由于蛋白质本身也是两性电解质，在电泳时，会影响pH梯度，这就要求形成pH梯度的物质必须有足够的缓冲能力来克服蛋白质的影响。
　　第一代载体两性电解质为Ampholine。是由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组成。它们有连续变化的氨基与羧基比，是形成pH梯度的基础。
　　第二代载体两性电解质为Pharmalyte。可得到较窄的pH范围，如pH5-6等。
　　目前，Ampholine和Pharmalyte均由GE Amarsham公司生产，其实就是我们常用的IPG buffer。
　　此外，BioRad公司生产的载体两性电解质为Biolyte。它是由丙烯乙胺与乙烯亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中再引入磺酸基团或磷酸基团后合成的。
2．pH梯度如何形成？
　　所有载体两性电解质分子都荷电，只是在溶液中正电荷和负电荷的基团数相等时，总的净电荷为零。当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，只净电荷为零时才停止。
3．载体两性电解质特性：
　　载体两性电解质具有分子量小，可溶性好，缓冲能力强，导电性均匀，紫外吸收低，不发光，容易从聚焦的蛋白中除去等。
4．固相pH胶条的出现：
　　当80年代，固相pH胶条出现后，载体两性电解质的作用除稳定胶条的pH梯度外，更主要的作用是其缓冲能力强和导电性均匀。在固相pH胶条中，载体两性电解质可遮蔽蛋白表面的疏水基团，明显增加蛋白质的溶解度。同时，由于载体两性电解质的导电性高于固相pH梯度胶，因此，它的存在可使IPG 胶条的聚焦时间明显缩短。
以上这些，是我从《蛋白质电泳实验技术》，科学出版社，郭尧君主编；和《Proteins and proteomics: A laboratory manual》R.J 辛普森著，分子克隆系列这两本书里学到的。一本中文，一本英文的，都很不错，推荐一下。

作者: standbyme 时间: 2014-4-19 20:37

两性电解质其实不加也没问题,适量加点最好,多加了就容易使电压升不上去(两性电解质是带电荷的,而且是多电荷).所以如果你按照常规加了两性电解质还是升不上电压,可以减少其使用浓度.

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　　从实验的角度来说这位战友说的已经很对了。

作者: greenbee 时间: 2014-4-19 20:38

两性电解质应该控制使用量,而且不能不加,否则拖尾.
加多了就电压上不去呢.

作者: nikonun 时间: 2014-4-19 20:38

我是基于固相IPG胶条前提提的问题。看来仍需再细看这两本书了。

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