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标题: 【求助】半干转时预染Marker不能转移到NC膜上面. [打印本页]

作者: 小螺号 时间: 2014-4-19 22:13 标题: 【求助】半干转时预染Marker不能转移到NC膜上面.

请教各位高手，我正在做wester blot 用的是半干转法，在转膜的时候预染Marker不能转移到NC膜上面，不知道是出了什么问题。转移缓冲液是按照分子克隆书上的配方配的，调节了PH值7。5，转移条件是:恒流按照0.8mA/cm2.电压是25V.我的转移时间是45min-1h,转完之后预染Marker还是留在胶上面。都转了好几次了都是这样的情况。

作者: milkdog 时间: 2014-4-19 22:13

1，Marker在胶上是完全转不过去还是不完全？是都没有转过去还是你目的条带的地方没有转过去？如果是前者，查看是不是短路、气泡没有排净之类的原因，如果是后者，延长转膜时间
2，目的蛋白有多大？如果很小转膜缓冲液就不要用SDS了
3，转膜缓冲液有没有加甲醇？膜有没有在转膜液里平衡20min以上？

作者: wzqzy 时间: 2014-4-19 22:14

除milkdog所述几点外，你的转膜电流可能也有点小。
我们半干转一般是2mA/cm2,转1.5小时。
当转膜结束时，电压一般从10几V升至40V左右。

作者: am10 时间: 2014-4-19 22:14

QUOTE:

原帖由 小螺号 于 2014-4-19 22:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教各位高手，我正在做wester blot 用的是半干转法，在转膜的时候预染Marker不能转移到NC膜上面，不知道是出了什么问题。转移缓冲液是按照分子克隆书上的配方配的，调节了PH值7。5，转移条件是:恒流按照0.8mA/cm2.电压是25V. ...

就个人的经验而言，有以下几点应该注意的：
1、半干转膜时必须把“三明治”旁边的电转液吸干；
2、“三明治”各层之间尽可能不要越级接触，会导致短路；
3、NC膜和滤纸一定要平衡足够时间；
4、电流和砖模时间可以肯定的说是够的，但是有一点一定要核实的--转膜仪是否通电。虽然有时电源灯是亮的，但是本身电路是“断路”的。转移多长时间都是无效的。通常这种情况发生在为了尽可能减少对转膜仪的触动，未插紧电泳仪插槽。
。。。。。。
Good luck！

作者: mysmdbl 时间: 2014-4-19 22:15

不知道为什么你的半干转需要那么长时间?是仪器说明上建议的吗?
目的蛋白的KD数是多少呢?
我用伯乐公司的半干转一般不超过30min.
楼上站友的话很有道理.

作者: 小螺号 时间: 2014-4-19 22:15

QUOTE:

原帖由 milkdog 于 2014-4-19 22:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1，Marker在胶上是完全转不过去还是不完全？是都没有转过去还是你目的条带的地方没有转过去？如果是前者，查看是不是短路、气泡没有排净之类的原因，如果是后者，延长转膜时间
2，目的蛋白有多大？如果很小转膜缓冲液就不要用SDS了
...

1。我的Marker是完全留在胶上面。短路有什么现象呢？我设定电压是25V，刚开始转的时候电压是7V，45min后电压会上升到13v。我的半干转仪器是石墨电极的。
2。目的蛋白70KD,转移缓冲液没有加SDS，甲醇加了200ML最后定容到1L。NC膜在转移缓冲液中平衡15min。

作者: 小螺号 时间: 2014-4-19 22:15

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原帖由 am10 于 2014-4-19 22:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

就个人的经验而言，有以下几点应该注意的：
1、半干转膜时必须把“三明治”旁边的电转液吸干；
2、“三明治”各层之间尽可能不要越级接触，会导致短路；
3、NC膜和滤纸一定要平衡足够时间；
4、电流和砖模时间可以肯定的说是够 ...

谢谢，am10的建议。
1。我去试试把“三明治”旁边的电转液吸干。
2。还有就是NC膜和滤纸的平衡时间是多久？我用的就是一般的滤纸，圆形的中速滤纸。不是whatman 3MM的那种。不知道是否有影响。
3。我的那个半干转仪器找不到说明书了，是一个黑黑的方型盒子，上面是正极，是石墨电极。没有标明牌子，看不出来。也没有电源灯，在整个转移过程中，电流恒定，电压从7V－13V。不知道这样会不会是“断路”的？“断路”会有哪些表现？

作者: milkdog 时间: 2014-4-19 22:16

你不会把正负极搞反了吧？上面是正极，那么从下到上应该是滤纸，胶，膜，滤纸，滤纸和膜可以在缓冲液里平衡半个小时。中速滤纸就可以，我不太明白你到底设置的是恒压还是恒流，若是恒流，用2mA/cm2 40min足够了，若是恒压15V 30min也够了，你这种情况应该没有短路，因为电压还在变化，变化范围7-13V说明你设定的电流可能是太小了。

作者: 小螺号 时间: 2014-4-19 22:16

QUOTE:

原帖由 milkdog 于 2014-4-19 22:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你不会把正负极搞反了吧？上面是正极，那么从下到上应该是滤纸，胶，膜，滤纸，滤纸和膜可以在缓冲液里平衡半个小时。中速滤纸就可以，我不太明白你到底设置的是恒压还是恒流，若是恒流，用2mA/cm2 40min足够了，若是恒压15V 30min也够 ...

正负极没有弄反，顺序从下(负）到上（正）滤纸－胶－膜－滤纸，我的半干转装置是恒流的，按照0.8mA/cm2,我的胶大小是5cm×8cm,转移的时候我设定的电流就是32mA。我去把电流调节大一点再转下看看。

作者: milkdog 时间: 2014-4-19 22:17

怪不得，电流太小了，5*8的胶设定120-180mA的恒流30min 20K的蛋白转得就很好。不知道你目的蛋白有多大。

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我的目的蛋白是70KD的,是否转移的时间要长一点呢?

作者: milkdog 时间: 2014-4-19 22:17

200mA 45-60min之间应该可以，这个需要自己摸索一下．

作者: 小螺号 时间: 2014-4-19 22:18

怪不得，电流太小了，5*8的胶设定120-180mA的恒流30min 20K的蛋白转得就很好。不知道你目的蛋白有多大。

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我的目的蛋白是70KD的,是否转移的时间要长一点呢?

作者: PPT 时间: 2014-4-19 22:18

。。。。我的半干转装置是恒流的，按照0.8mA/cm2,我的胶大小是5cm×8cm,转移的时候我设定的电流就是32mA。我去把电流调节大一点再转下看看。

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我晕，早就提醒你了，电流太小，应2mA/cm2，那么你用5cm*8cm的胶面积，应用至少80mA电流。

作者: yyaxw84 时间: 2014-4-19 22:19

1。我去试试把“三明治”旁边的电转液吸干。
2。还有就是NC膜和滤纸的平衡时间是多久？我用的就是一般的滤纸，圆形的中速滤纸。不是whatman 3MM的那种。不知道是否有影响。
3。我的那个半干转仪器找不到说明书了，是一个黑黑的方型盒子，上面是正极，是石墨电极。没有标明牌子，看不出来。也没有电源灯，在整个转移过程中，电流恒定，电压从7V－13V。不知道这样会不会是“断路”的？“断路”会有哪些表现？
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针对性的回答你的问题：
1、电转液最好是吸干，用你剪滤纸的下脚料就足矣（省材料嘛，嘿嘿）；
2、滤纸的规格并不是很重要，用普通滤纸也可以。其主要作用就是提供一个离子环境；
3、我只是通过你的实验参数推测你的电转电路可能有问题。我们用的半干转膜仪15分钟搞定，其提供的电源是9V。
建议检查所有接头是否插好。
不知道你用万能表可不可以测一下电转仪正负极的电压或者电流。
Good luck！

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