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标题: 【求助】请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊？ [打印本页]

作者: am10 时间: 2014-5-12 16:47 标题: 【求助】请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊？

请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊？做了几次预实验结果都不理想，跑的是细胞裂解液，不知道跑分子量大的蛋白是和小分子量蛋白有什么区别？包括转膜液、转移时间等等，希望大家指教。

作者: plaa 时间: 2014-5-12 16:47

我做过几次大分子的蛋白，我们采用的是8%的胶，湿转法，低电压4度过夜或冰浴70V恒压转8-10小时，做出的结果还是比较特异的
希望这些对你有帮助

作者: PINK 时间: 2014-5-12 16:48

大分子蛋白跑胶时难度大点，最好用低浓度的胶，我们用的是6%的胶，取胶时容易破哦！转膜时一般低电压长时间冰箱内转效果会好些，我们用60mA,转膜过夜。转移液倒是没有什么特别要求！祝实验顺利！

作者: 04906 时间: 2014-5-12 16:48

我做的也是6%的胶，冰浴，200MA，210min。取胶铺胶时用塑料小铲子带着转膜缓冲液操作比较好。

作者: kuohao17 时间: 2014-5-12 16:49

我做的也是6%的胶，冰浴，200MA，210min。取胶铺胶时用塑料小铲子带着转膜缓冲液操作比较好。

作者: am10 时间: 2014-5-12 16:50

好像大家的转膜条件比我的强烈一点，我一般用的是100v转1个小时，或者20mA过夜转，彩虹Marker一般转的还可以，是不是弱了一点啊，难道问题就在这里？

作者: zzzz 时间: 2014-5-12 16:50

我做560kd,建议40ma，过夜（12-18小时）

作者: abc816 时间: 2014-5-12 16:51

我也做过２００ＫＤ的大分子，条件还是比较成熟，希望对你有用．
跑胶：分离胶用６％，如果要同时做内参切两快胶可以用　８％，只要根据marker把目的蛋白切进去就可以．
转膜：大分子建议湿转效果比较好，条件可能根据仪器不同而有所不同，我用过ＢＩＯ－ＲＡＤ的湿转仪，恒压１００Ｖ转２．５小时．
　　　半干转也可以，条件也相对比较容易控制，恒流１．５－２mA/cm2,转２．５小时．对于大分子蛋白转膜液中最好加入ＳＤＳ．
希望实验成功．

作者: wawa 时间: 2014-5-12 16:51

请问楼上战友,大分子蛋白转膜液中最好加入ＳＤＳ,那么加多少浓度较合适?你是不是加了之后效果比较好呢

作者: hustwb 时间: 2014-5-12 16:51

我用的胶浓度7.5%，半干转，恒流2.5mA/cm2,转２.5h．

作者: Kiwi2021 时间: 2022-8-22 12:03

取胶铺胶时用塑料小铲子带着转膜缓冲液操作比较好。

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作者: 一个著名的按键 时间: 2022-10-11 11:52 标题: 回复 #1 am10 的帖子

我当时做的是180kd的蛋白，不喜欢太软的胶，配了10%的胶，转膜液加了5%的SDS，恒流100mA转膜2h，转出来还可以在胶上看到一点170的marker条带，用胶去跑个考染也可以看到不少蛋白，但是由于膜上的蛋白已经足够我用了，我就没有再继续折腾了。

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作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-26 16:50

对于较大的蛋白（如200 kDa），在进行Western Blot实验时，确实需要注意一些因素，以下是一些建议：

1. 蛋白分离：由于蛋白分子量较大，传统的SDS-PAGE电泳可能不适用。可以考虑使用较低的聚丙烯酰胺浓度（例如6％或8％）或使用Bis-Tris缓冲系统。此外，使用长时间的电泳（如慢速电泳）可能更适合分离大分子量的蛋白。

2. 转膜条件：由于蛋白分子量较大，转膜的条件需要进行优化。可能需要使用低电流和较长的转膜时间来确保蛋白成功转移到膜上。

3. 转膜膜：选择适合大分子量蛋白的转膜膜。PVDF膜通常比NC膜更适合转移大蛋白，因为它具有更好的蛋白结合性能。

4. 阻断缓冲液：使用合适的阻断缓冲液，例如5％的脱脂奶粉或3％的牛血清白蛋白，来防止非特异性结合。

5. 抗体选择：确保使用的一抗和二抗对目标蛋白有较高的特异性和敏感性。

6. 标记的蛋白量：对于大分子量的蛋白，可能需要加载更多的样品量，以确保可以检测到充足的信号。

7. 选择合适的标准品：如果需要估算蛋白的分子量，使用合适的蛋白标准品，例如蛋白分子量标尺。

8. 成像条件：根据实验结果的要求和蛋白表达水平，选择合适的曝光时间以获取清晰的图像。

以上建议是为了优化大分子量蛋白的Western Blot实验。注意，每个实验室和蛋白质可能存在差异，因此可能需要根据实验结果进行进一步优化。预实验是很重要的，通过多次尝试和优化，你会逐渐找到最适合你实验条件的方法。祝你实验顺利！

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