标题:
【求助】细胞破碎后分离蛋白的方法
[打印本页]
作者:
雪花子
时间:
2014-5-15 15:10
标题:
【求助】细胞破碎后分离蛋白的方法
请问各位战友,我用5000r/min的速度来沉淀蛋白,再跑非变性胶,但什么都没有,怎么回事啊,我该用多少的速度来沉淀阿
作者:
flower-201
时间:
2014-5-15 15:10
你破碎的是什么细胞,会不会降解?
作者:
雪花子
时间:
2014-5-15 15:11
我破碎的是e.coli细胞
作者:
hold住
时间:
2014-5-15 15:13
离心时间多久?5000r/min,5min应该就有沉淀了。如果只是想要收菌检测是否表达,尽可以10000rpm离心1min就可以了,高速又不会对蛋白有什么损害的。而且,菌体沉淀是肉眼可以看到的呀。
所以电泳没有东西(什么都没有),电极有没有接反了?loading buffer有没有问题?
作者:
fsdd817
时间:
2014-5-15 15:13
同意楼上的说法
尽可以10000rpm离心1min就可以了,高速又不会对蛋白有什么损害的
作者:
kuohao17
时间:
2014-5-15 15:15
请问各位战友,我用5000r/min的速度来沉淀蛋白,再跑非变性胶,但什么都没有,怎么回事啊,我该用多少的速度来沉淀阿
==========================================
您是沉淀蛋白呢还是沉淀破碎的细胞?
5000 rpm,g force是多少呢?rpm没有多大意义;
什么也没有?是什么情况?
作者:
tangxin_80
时间:
2014-5-15 15:16
细胞破碎所选用的方法很重要,如果是超声破碎蛋白会很容易分离出.注意超声时间.如果想要离心破碎的细胞内容物离心选择,10000rpm 5min.去定量跑SDS电泳,跑时可以观察MARKER有无,来判断你所配制的胶是否成功^.^
PS:你的5000RPM沉淀中不是蛋白吧,破碎的细胞沉淀里面或许有你需要的蛋白(不太可能),但含量微少,大部分应该在上清中。
作者:
yjf1026
时间:
2014-5-15 15:16
e.coli细胞表达的蛋白如果是包涵体才会沉淀,可溶的肯定在上清。一般情况下沉淀和上清都要跑电泳去验证,包涵体和可溶表达有可能同时存在,也有可能相互转化。
作者:
moonlight45
时间:
2014-5-15 15:17
QUOTE:
原帖由
yjf1026
于 2014-5-15 15:16 发表
bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '
%s
')
e.coli细胞表达的蛋白如果是包涵体才会沉淀,可溶的肯定在上清。一般情况下沉淀和上清都要跑电泳去验证,包涵体和可溶表达有可能同时存在,也有可能相互转化。 ...
如果是膜蛋白,而重悬buffer里面没有合适的detergent的话,也是会在沉淀里面的。
欢迎光临 分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)
Powered by Discuz! 5.5.0