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标题: 【求助】GST融合蛋白纯化不出来 [打印本页]

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:01 标题: 【求助】GST融合蛋白纯化不出来

我要纯化的融合蛋白加GST一共100多KD。做了一个多月了还是纯化不出来。给我质粒的那位学者说这种蛋白很容易被水解，诱导表达后跑SDS-PAGE看不出增强带，建议我直接纯化然后再跑电泳。可是我纯化后跑电泳还是看不到任何带。我个人认为要是蛋白降解导致没有带的话，至少应该能在电泳后看到GST或者其他降解片段，可是我却没看到任何条带。我在诱导时已经加了1mM的PMSF，而且在裂解液里把实验室有的蛋白酶抑制剂都加了，还是没什么用。这位学者很友好，把他们的实验方法也给我了，其中就是一种抑制剂不一样，他们用的是AEBSF我用的是PMSF。我是束手无策了，各位有什么高见救救我吧。非常感谢！

作者: hold住 时间: 2014-5-15 16:01

本人认为降解不会降解得那么厉害吧,估计是你的蛋白质根本就没有表达,你最好摸一下诱导表达的条件.

作者: 小糖块 时间: 2014-5-15 16:02

首先确定，质粒的确已经转染了。
质粒一样是不够的，表达菌株也是很重要的。请问用的是一样的表达菌株吗？
如果是原核，BL21就可以，如果蛋白有毒性，用BL21（plys）会好一些。
如果是真核蛋白，建议用rosetta菌株。
如果你确定用的条件一样，你可以诱导后一个小时取样，即使讲解，也不会降解的这么快，否则就是你的蛋白根本没有表达。

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:02

我的蛋白是人源的，表达用的是BL21。诱导表达后杂GST发现在正确的位置上根本没有带，而是在分子量较小的位置上有些带，但是位置肯定不对。说明可能没有表达，至于为什么能杂出GST，我不能解释。诱导条件我也摸索过，低温也试过。请问novel1115，你认为诱导条件应该还怎么摸索啊，谢谢！

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:02

请问楼上：（1）我转化了BL21后提取的质粒经过酶切切出的带奇形怪状的，全质粒感觉位置对（其他同学也说BL21提的质粒就是这样的，不能说明问题）。你遇到过吗？
（2）至于毒性怎么确定可能没有吧，因为转化后长得挺好的。还应该怎么确定有没有毒性？
（3）你建议用rosetta菌株中的哪种？
非常感谢！我在线等你们回贴

作者: 小糖块 时间: 2014-5-15 16:03

真核蛋白最好不要用BL21，用Rosetta(de3)就可以了。
如果蛋白有毒性，诱导之后，od会长的很慢。甚至降低，你的应该不是。
你可以用pCRtest一下就可以了。

作者: 小糖块 时间: 2014-5-15 16:03

根据你说的情况，我建议你换ROsetta，你可以查查是不是你的测序序列中是不是有稀有密码字，存在一种可能，你的蛋白表达到稀有密码子就停止了。

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:04

非常感谢小糖块！我已经定了引物，可以做。
如果像你所说的有稀有密码子的话，有没有可能表达啊？给我的protocol也是转染BL21的。

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:04

我查了蛋白的CDS区，发现721个密码子中有55个稀有密码子。用Rosetta(de3)就可以补充了吗？有人说用Rosetta2啊。请问我到底该用哪种Rosetta？谢谢！

作者: 987789 时间: 2014-5-15 16:04

有3个可能：
1你的蛋白可能没有表达。
2绝对不是完全降解，你可放宽心。
3可能纯化过程中没有结合。
大蛋白的表达本身就是一个难题，你的分子量大于10万，还是异源，给表达造成难度。我不知道你为什么要采用融合表达，估计也是为了增加融合蛋白的溶解度，但是由于分子量大，在原核细胞里的折叠一定有问题。很有可能结构的原因导致纯化过程中没有结合。
大蛋白的确容易降解，更容易受到蛋白水解酶的攻击，但是没有那么快，只要表达收集后快速纯化就可以了。无论你将来的规模多大，都要少用抑制剂。
建议：从上游找原因。

作者: caihong 时间: 2014-5-15 16:05

建议先不要做纯化部分的实验
在表达阶段，多做几个梯度实验，比较一下不同温度、诱导剂浓度和诱导时间对表达的影响，并且同事分析不溶蛋白与可溶蛋白的情况，需要做一个wb检测，才能确定你的蛋白究竟是否表达。gst融合蛋白一般可溶性是比较好的，分子量从30－100kDa的，都有希望做出可溶的，所以表达需要优化一下。
蛋白抽提部分，也需要做的细致一些，GST融合蛋白是不稳定，而且表达过程容易产生终止，后续处理时会发生标签脱落等问题，破菌一步很关键，当然不是抑制剂加的越多越好，其实只要加一种inhibitor cocktail就可以了，抑制剂太多会影响纯化，也有可能使蛋白质失活
我觉得你把前面的实验先做好，再考虑纯化，不要一股脑全做下来，否则很难分析。

作者: vivian4123 时间: 2014-5-15 16:05

QUOTE:

原帖由 caihong 于 2014-5-15 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

建议先不要做纯化部分的实验
在表达阶段，多做几个梯度实验，比较一下不同温度、诱导剂浓度和诱导时间对表达的影响，并且同事分析不溶蛋白与可溶蛋白的情况，需要做一个wb检测，才能确定你的蛋白究竟是否表达。gst融合蛋白一 ...

楼上说的标签脱落是什么意思呢难道表达出来的蛋白中的GST会掉下来?
不过我倒是发现又时候蛋白倒是真的很容易降解而降解的位置刚好在GST处?我们用过凝血酶酶切下的GST做过电泳,位置是一样的
此外不确定你说的inhibitor cocktail是用什么? 我们偶尔会用叠氮钠一类的抑菌的东西

作者: caihong 时间: 2014-5-15 16:05 标题: 回复 #12 vivian4123 的帖子

GST确实会从蛋白上掉下来，具体原因也很难说，并不都是蛋白酶或者降解产生的。
inhibitor cocktail是一种商品化的蛋白酶抑制剂，里面有多种成分，可以抑制多种蛋白酶，做成片剂的形式，使用的时候按照一定比例溶解就可以了。和叠氮钠是两回事。
roche的还不错。

作者: 小糖块 时间: 2014-5-15 16:06

我要纯化的融合蛋白加GST一共100多KD。做了一个多月了还是纯化不出来。给我质粒的那位学者说这种蛋白很容易被水解，诱导表达后跑SDS-PAGE看不出增强带，建议我直接纯化然后再跑电泳。可是我纯化后跑电泳还是看不到任何带。我个人认为要是蛋白降解导致没有带的话，至少应该能在电泳后看到GST或者其他降解片段，可是我却没看到任何条带。我在诱导时已经加了1mM的PMSF，而且在裂解液里把实验室有的蛋白酶抑制剂都加了，还是没什么用。这位学者很友好，把他们的实验方法也给我了，其中就是一种抑制剂不一样，他们用的是AEBSF我用的是PMSF。我是束手无策了，各位有什么高见救救我吧。非常感谢！

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我们实验室经常纯化真核蛋白，包括人类的、拟南芥的。
通常我认为GST融合表达，在促进折叠方面方面比起MBP融合要差的多，但是表达情况还是很好的，一般表达量还是特别的大，但是经常在包含体中。如果你的蛋白比较重要的话，我倒是建议你用Pmal系列的。在促进折叠方面，效果好一些，至于表达情况就要看你蛋白自身的性质了。
用Rosetta(DE3)就可以了。

作者: vivian4123 时间: 2014-5-15 16:07

纯化GST蛋白真的需要运气的
有的很容易做，一步就可以很纯
走运一点的可以再加一步肝素亲和或者别的什么
很多的结果都会出现杂带和GST附近的降解蛋白，就非常难办了。
即使用昆虫表达系统，也不能完全排除这些问题。
如果你的蛋白纯度要求较高，并且最终不能有gst标签的话，建议不要使用这个系统，最终切除标签也很麻烦，需要引入凝血酶还有分离凝血酶和目标蛋白的其他因子

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:07

谢谢各位高见，我会试着在表达上下功夫。可能更本没表达。

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:07

我查了蛋白的CDS区，发现721个密码子中有55个稀有密码子。用Rosetta(de3)就可以补充了吗？有人说用Rosetta2啊。请问我到底该用哪种Rosetta？谢谢！

作者: 小糖块 时间: 2014-5-15 16:08

你可以试试Rosetta(de3)，我们实验室表达人的一般都用它，效果是大大的好啊

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:08

请问小糖块：Rosetta(de3)在哪里卖？

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:09

你们实验室现在还有吗？能不能提供一点点救急啊？我的实验卡到这里没法进行下去了。

作者: rxcc33 时间: 2014-5-15 16:09

我换Ｒosetta2(DE3)菌做了，细菌生长及其缓慢（而BL21中的生长速度正常）。SDS-PAGE还是没看到想要的增强带。之后用anti-GST 做western blot 发现都有两条增强带。而且发现ＢＬ２１和Ｒosetta2(DE3)中的的增强带位置一样。不能确定是不是我要表达的蛋白。

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