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标题: 【求助】请问Western Blot 中设定内参的用途是什么? [打印本页]

作者: eve_49 时间: 2014-5-15 17:12 标题: 【求助】请问Western Blot 中设定内参的用途是什么?

各位大侠小弟是新手请问Western Blot 中设定内参的用途是什么?一般选择什么做内参哪.谢谢

作者: mimili_901 时间: 2014-5-15 17:12

内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。
常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。

作者: tangxin_80 时间: 2014-5-15 17:12

你说你的上样量一样，证据呢？而用内参，一幕了然。因为尽管在前期你进行了蛋白定量,但是你并不能保证你在上样过程中枪是否准,而且在上样过程中还会出现一些意外情况,比如说你的样飘了,等等,因此还需要内参进行定量.

作者: one 时间: 2014-5-15 17:13

是不是只要做WB就必须/应该用内参啊

作者: yapuyapu 时间: 2014-5-15 17:13

理论上是得，才能证明你上样量一致等等问题，嘿嘿

作者: hold住 时间: 2014-5-15 17:13

想请教一下，内参的具体使用方法。是将两张膜一张上待检测蛋白的抗体，另一张上内参的抗体，然后曝光后进行比较吗？谢谢！

作者: wmp1234 时间: 2014-5-15 17:14

这要看你的待检测蛋白的分子量大小与内参的分子量大小差别大不大。如果差别大，可以转在一张膜上，转完后将膜在内参分子量对应位置上一点处剪下来，然后分别孵育；如果差别不大，那就只好分次分别各转一次膜，然后孵育了。

作者: eve_49 时间: 2014-5-15 17:14

请问楼上，为什么“差别大，可以转在一张膜上，转完后将膜在内参分子量对应位置上一点处剪下来，然后分别孵育；如果差别不大，那就只好分次分别各转一次膜”。

作者: cj_mondy 时间: 2014-5-15 17:14

我觉得可以在一张膜上进行，清楚，直观。
你先不做内参，等western blot结果出来后，觉得有价值，可以将ecl洗掉，重新将膜用actin孵育，加二抗，再加ECl，显影即可。

作者: wmp1234 时间: 2014-5-15 17:15

1.如果待检测蛋白的分子量大小与内参的分子量大小差别不大，转膜后位置很可能接近，怎么敢肯定就剪对了呢？
2.ECL可以这样，用DAB显色就不能像楼上所说了吧。

作者: fox_79 时间: 2014-5-15 17:15

想请教一下，内参和目的蛋白可以跑两块胶吗，因为我跑目的蛋白用的7.5％的胶，如果用它跑actin效果不好很难看，我可以同体积上另一块胶吗？

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