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标题: 【求助】有谁在提取鼠大脑线粒体 [打印本页]

作者: 911 时间: 2014-5-24 14:55 标题: 【求助】有谁在提取鼠大脑线粒体

我想提鼠大脑线粒体跑2D请问谁有好的提取方法和好的裂解液，能否交流一下

作者: IAM007 时间: 2014-5-24 14:55

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作者: IAM007 时间: 2014-5-24 15:01

另外，你做的是全脑还是某些特定组织？根据不同的组织，在提取的过程中有些步骤是需要改动一点以达到更好的效果，可以交流。

作者: u234 时间: 2014-5-24 15:01

蛋白酶抑制剂我建议用BioVison 的 protease inhibitor cocktail 因为我试过仅用 PMSF 效果不是太好

作者: 911 时间: 2014-5-24 15:02

我提的是大脑皮层，我想问一下分离大脑皮层时下面粘的白质怎么剥离，许不需要剥离

作者: 911 时间: 2014-5-24 15:04

1、我想请问一下我提大脑皮层线粒体，提出的线粒体有文献报道不用含
EDTA的分离介质悬浮，对不对？
2、分离介质用EDTA－k和EDTA－Na有什么不同
3、如果用含EDTA－k的分离介质悬浮影不影响后面的二维电泳
4、如果裂解大脑皮层线粒体所用的裂解液有没有成品，如果自己配，有没有效果更好的裂解液，
5、裂解液的量用多少
6、请问一下如果银染18cm的胶条用多大的上样量合适
顺便感谢二楼的兄弟您给我的是心肌线粒体的提取，请问有没有提取大脑线粒体纯度较高的方法，谢谢！！

作者: 911 时间: 2014-5-24 15:05

半个大脑皮层提取的线粒体能提取多少蛋白，够不够跑二维电泳

作者: 911 时间: 2014-5-24 15:06

希望你能不能指点一下，还有上次那个线粒体的裂解液我没有看明白咋用，能不能具体解释一下。

作者: IAM007 时间: 2014-5-24 15:06

很抱歉没能及时给你回复，线粒体的提取方法较简单、通用。不同组织在匀浆（或超声破碎）的处理过程是有些许差异的，但在进行梯度离心及以后的处理是相同的。依据我回心肌线粒体的方法提没问题。
将裂解液加入你提取的线粒体样品中，加入PMSF、cocktail和EDTA（我一直加的，效果不错），冰上放置一会（10min左右），超声破碎，功率别太强，依据你的超声破碎仪而定。然后室温放置一小时。再然后脱盐、浓缩，测浓度、等点聚焦......
你做的是大鼠（以500g/只计）是吧？半边的大脑皮层，提的线粒体蛋白能保证你做银染的量，若需要也可以尝试pool在一起做考染。不知你还有什么问题？

作者: xiaoxiaoniao 时间: 2014-5-24 15:07

我请教你个问题，我用PERCOLL纯化心肌线粒体，应该怎么做啊？谢

作者: am10 时间: 2014-5-24 15:08

我也准备做，但是是提大鼠海马的。
我查到了SIGMA的试剂盒配方，准备买东西自己配，不知会怎么样。
查文献的配方好像没有一个是相同的。也许和所提脏器及提后做的监测指标有关。
另外提醒楼主，心肌是“硬组织“和脑/肝这些“软组织“，提的方法还有所不同的，因为一些试剂盒就表明提的是某脏器的线粒体。SIGMA的试剂盒里面有的试剂是提心肌需要，而脑就不需要的。
非常期盼有提过大鼠脑线粒体的高手现身！

作者: 911 时间: 2014-5-24 15:08

我提完大脑皮层线粒体后加入裂解液后超声室温放置2小时后离心25000g30min后居然在离心管上端出现了一层脂质，这是为什么呀，还是只要吸取中间的澄清液就行了？盼望高手指点！！

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