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标题: 【求助】WB转的一张膜上能同时结合两种或更多次一抗吗？ [打印本页]

作者: purrr 时间: 2014-5-28 15:36 标题: 【求助】WB转的一张膜上能同时结合两种或更多次一抗吗？

我刚开始准备做WB，因标本收集很难，提的蛋白也较少，请教WB时，转的一张膜上能同时结合两种或更多次一抗吗？或结合一种一抗后，洗3次后再与另一种一抗孵育？（此前需要牛奶封闭吗？）还是显影后再洗脱后再可结合另一种一抗？？请各位有经验的老师们发表发表意见，请各位不吝赐教，已救燃眉之急！！！！另：准备购买质量好的一抗，避免延误实验的进行，请各位有经验的老师们发表发表意见，那个公司的一抗质量最好？R&D?Sigma?State?ABCAM??? 或其他？？？不胜感激！！！

作者: is2011 时间: 2014-5-28 15:36

你时用的什么膜阿？millipore的PVDF可以用蛋白解吸液将抗体及封闭液洗掉，然后重新封闭，重新加抗体就行了。详见millipore公司
cuturl('http://www.millipore.com/') ，搜索Immobilon ，可以下载各种型号的说明书。我把我用的Immobilon－PSQ说明书附在后面了！一抗的质量R&D，Sigma，ABCAM的都挺好的，就是santacroze（大概这么拼的吧）的种类多，但质量不敢恭维。晶美公司代理的ABCAM的抗体现在有活动－买一抗送内参一抗，挺好的，我买了他们公司的，要比sigama的便宜。

作者: tuuu2 时间: 2014-5-28 15:37

转的一张膜上能同时结合两种抗体，我做过的，效果也挺好的。多次抗体孵育我没做过，理论上可行，但是效果就不知道了。做发完光后，用TBST洗三次膜，然后再用封闭液封闭2h后者过夜，然后再用另一个抗体孵育。但是要注意，用DAB显色过的不能重复孵育。

作者: remenb 时间: 2014-5-28 15:37

可以的，只要你第一次显色后再重新充分用PBS洗涤，然后再孵育你的第二个一抗，效果还是不错的。我以前经常这样做的。

作者: summerxx 时间: 2014-5-28 15:38

在Western Blotting试验中，完成第一轮杂交后，经常需要重复使用同一张膜，进行第二次/第三次杂交，最为常见的情况包括：
(1) 内参杂交。
(2) 信号传递研究中，检测其他目的蛋白。
(3) 检测目的蛋白的磷酸化(phosphorylation)或甲基化(methalation)后，继续检测总目的蛋白的表达。
利用同一张膜进行多次蛋白检测，不仅节省蛋白样品、省略蛋白电泳和膜转移等耗费性步骤，而且可消除重新上样带来的误差，使可比性更强。
进行新一轮杂交前，需首先去除第一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。传统的方法是使用具有强烈刺激性臭味的b-巯基乙醇， 55℃水浴振荡30分钟，操作极不方便。
我用的是华特生Western Stripping Solution 不用b-巯基乙醇，室温20～30分钟，可去除前一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。可重复使用2～4次。

作者: purrr 时间: 2014-5-28 15:38

我在说明书里未找到具体的"用蛋白解吸液将抗体及封闭液洗掉，然后重新封闭，重新加抗体就行了"呀？我要测的蛋白是50几KD的，蛋白解吸液就是TBST吗？R&D的一抗您用过吗？它附有阳性对照吗？希望得到更多的信息。谢谢。

作者: purrr 时间: 2014-5-28 15:38

请问：“华特生Western Stripping Solution 不用b-巯基乙醇，室温20～30分钟，可去除前一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。可重复使用2～4次。” 需要震荡吗？现在室温低可以吗？可以去除前面已和相应的抗原结合的一抗吗？？？（我总觉的已和相应的抗原特异结合是较强的，而不易被解开）还是未结合的多余的一抗和二抗？并请问，前几位使用的TBST 洗脱，就是华特生Western Stripping Solution 吗？用TBST洗脱可以吗？能重复使用2～4次吗？效果怎样？还请多多指教为谢，谢谢！！！

作者: plaa 时间: 2014-5-28 15:39

我用的是华特生Western Stripping Solution 不用b-巯基乙醇，室温20～30分钟，可去除前一轮杂交时结合在膜上的一抗和二抗。可重复使用2～4次。

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不知您所说的“华特生Western Stripping Solution ”是购买的还是自配的，每次处理的时间都固定吗？望不吝赐教！

作者: plaa 时间: 2014-5-28 15:39

我在说明书里未找到具体的"用蛋白解吸液将抗体及封闭液洗掉，然后重新封闭，重新加抗体就行了"呀？我要测的蛋白是50几KD的，蛋白解吸液就是TBST吗？R&D的一抗您用过吗？它附有阳性对照吗？希望得到更多的信息。谢谢。

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R&D公司的抗体我正在用，感觉还可以，至少我是做出来了！但我认为该公司并不是很让人放心的公司，记得当初在分装抗体时（—20度保存，没有santa和CST的＋4度保存的抗体方便），说明书和包装上均没有说明抗体的浓度而只有抗体的质量数，让我无法稀释使用！通过代理公司沟通，才知道是由于R&D疏忽没有在说明书上标明，重新给我发来说明书补充！
我做的是glut4

作者: yes4 时间: 2014-5-28 15:45

不知您所说的“华特生Western Stripping Solution ”是购买的还是自配的，每次处理的时间都固定吗？望不吝赐教！

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买的.北京的欣源嘉和就有卖的

作者: remenb 时间: 2014-5-28 15:46

我也有问题，既然抗体是特异性结合，为什么不能把两个一抗混在一起孵育？二抗就可以用同一个。这样可行吗？请高手赐教！

作者: xyw5 时间: 2014-5-28 15:46

也是听说需要洗脱,可是有人使用发光过的再TBST洗一下,然后再加一抗孵育就可以了,效果也可以.

作者: plaa 时间: 2014-5-28 15:48

膜显色后接下来有这么几种做法：
（1）  可用TBST漂洗后直接加ＥＣＬ压片；
（2）  TBST飘洗后重加二抗孵育，再加ＥＣＬ压片；
（3）  洗脱一抗二抗后重新牛奶封闭继续后续检测。
一般可用（1）、(3)两种方法都可，我做过的，质量还可以，但效果可能逐渐减低，四次之后已经压不出带了。

作者: purrr 时间: 2014-5-28 15:50

我看有人洗膜时是用TBST,有人用PBS+TW20，甚有人直接用PBS，有区别吗？效果好的应是怎样？？？

作者: cj_mondy 时间: 2014-5-28 15:50

我在说明书里未找到具体的"用蛋白解吸液将抗体及封闭液洗掉，然后重新封闭，重新加抗体就行了"呀？我要测的蛋白是50几KD的，蛋白解吸液就是TBST吗？R&D的一抗您用过吗？它附有阳性对照吗？希望得到更多的信息。谢谢。

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你可以根据你的pvdf膜的型号在线搜索一下吧，
Stripping and Reprobing for Western Blot
Buffers:
 Erasure Buffer: 2% (w/v) SDS , 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 at 20°C), 100 mM b-mercaptoethanol.
 TS Buffer: 10 mM Tris-HCl (pH 7.4 at 20°C), 150 mM NaCl.
 Blocking Solution: 5% (w/v) nonfat dry milk in PBST Buffer
Protocol:
After performing chemiluminescent western blot development and film exposure:
1. Strip antibodies by incubating blot for 30-90 minutes at 50°C in Erasure Buffer.
2. Wash 2 times, 10 minutes each wash, in PBST Buffer.
3. Block for 2.5 hours in Blocking Solution.
4. Incubate with new primary and secondary antibodies.
5. Wash three times with appropriate wash solution after each antibody incubation.
6. React 1 minute with LumiGLOÒ Chemiluminescent Substrate.
7. Expose to X-ray film for desired amount of time and develop.
我说的送阳性对照是ABCAM公司近期的活动，其它公司的我就不知了：）

作者: purrr 时间: 2014-5-28 15:51

不知您所说的“华特生Western Stripping Solution ”是购买的还是自配的，每次处理的时间都固定吗？望不吝赐教！
买的.北京的欣源嘉和就有卖的 "
请问，
北京的欣源嘉和是什么公司，有网址吗？我怎么找不到？

作者: purrr 时间: 2014-5-28 15:52

买的.北京的欣源嘉和就有卖的

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不知您所说的“华特生Western Stripping Solution ”是购买的还是自配的，每次处理的时间都固定吗？望不吝赐教！
买的.北京的欣源嘉和就有卖的 "
请问，
北京的欣源嘉和是什么公司，有网址吗？我怎么找不到？

作者: wmp1234 时间: 2014-5-28 15:52

Stripping buffer主要是有以下几种方法组成，其强度不断增加:
1.TBST-T与PBS轮流多洗洗
2..0.02-0.2M glycine,pH2-3＋(1-2% SDS,optional) +(3M NaCl,optional,反正就是高盐) +0.05-0.01% Tween 20,温度方面可以选择RT,也可以选择50-80度,一般30min;
3.yoyololo所说的方法.
不过一般最佳的stripping buffer推荐你买Pierce的Restore Western Blot Stripping buffer,其他杂牌公司的Stripping buffer不太保证质量

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