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标题: 【求助】IPTG诱导蛋白表达的问题！ [打印本页]

作者: zhy平平 时间: 2014-5-31 10:27 标题: 【求助】IPTG诱导蛋白表达的问题！

各位战友，大家好！最近我用IPTG诱导蛋白表达，第一次诱导的蛋白表达出来了（诱导浓度是0.1mM）。接下来我就按照师兄的说法，把已经诱导出蛋白的菌液吸出5ul到一个含有5ml LB的试管中摇到OD大约为0.6到0.8的时候再取出一部分细菌裂解后鉴定诱导的蛋白是否在裂解液上清，结果不论是在沉淀还是在上清中都不出现诱导的条带了。然后我又把后来摇的这部分细菌全菌体跑了一次电泳，结果也没有条带了。我又重复了好几次都是这样。于是我又把第一次诱导后剩余的细菌再来跑电泳，还是和以前的一样有条带。师兄说可能是因为细菌状态不好了，让我重新再来一遍。但是另外一个师姐说细菌在4度冰箱里放几天一般都不会有什么问题，而我的细菌在冰箱里放了也就只有一个礼拜不到。我看到园子里有人说加过IPTG后的细菌质粒会丢失，所以我现在想问问我的细菌后来诱导不出蛋白了是不是因为以前加过IPTG诱导，所以后面再诱导就诱导不出来了？我现在已经被这个问题弄得焦头烂额了，希望有经验的战友能够提供一点意见，非常感谢！

作者: zhenxin 时间: 2014-5-31 10:27

这样的诱导表达方法可行，但不是每种质粒都能这样来。应该先按照一般的诱导表达程序做一次。
1）复苏
2）培养到适当浓度时，OD 600 达到 0.5 左右，加入 IPTG 诱导。
楼主的表达程序似乎已经包含了这样的工作，也有表达，不是很好么。这个表达很可能依赖 IPTG 的高浓度存在，当 IPTG 浓度下降时，启动子会关闭。不像有的情况，IPTG 会留在启动子上，哪怕细胞分裂繁殖，IPTG 仍保留。

作者: zhy平平 时间: 2014-5-31 10:28

可能我没有说清楚，我是取出5ul到5ml菌液中摇到一定浓度时，再加IPTG到0.1mM诱导的，因为师兄说前面的菌液中IPTG已经稀释到很小的浓度了，所以可以忽略不计。

作者: utt0989 时间: 2014-5-31 10:29

按理说这样做也是可以的，我以前也这样做过，没有出现楼主这种情况。我怀疑楼主所表达的蛋白对宿主菌有影响，表达后菌产生某种变异或保护性机制，使用这种菌再做诱导时就不表达了，建议以原始菌种做诱导表达。

作者: youyou99 时间: 2014-5-31 10:29

重新来过,有时是没有理由的,找也找不出,只有重新做，很多人都遇到过.我觉得还是不同质粒的稳定性问题.

作者: hulu呼噜 时间: 2014-5-31 10:30

这很可能是诱导后的菌株产生了变化，做诱导表达最好用原始的单克隆菌株，我觉得你没有必要在这个问题上花费心事。

作者: DNA 时间: 2014-5-31 10:30

OD在0.5的时候就要加IPTG了
另外，我一般都加IPTG后摇菌4小时后，当天或者次日全都裂解后，上清沉淀分别冻在-20度

作者: qianqin1977 时间: 2014-5-31 10:30

作为表达菌，最好每次表达前均用刚转化的表达菌，否则表达量很低。

作者: ending 时间: 2014-5-31 10:31

你诱导的之前每次都要测OD在值吗．到了０．５在加ＩＰＴＧ吗

作者: glass 时间: 2014-5-31 10:31

我觉的没必要每次作都测OD值吧!
按照经验差不多就可以吧
而且做诱导表达最好用原始的单克隆菌株

作者: remenb 时间: 2014-5-31 10:31

我同学也碰到过这种问题，建议将构建好的表达载体再转化一次宿主菌或者重新挑选单菌落，可能比如此反复更省时间。

作者: 大尾巴 时间: 2014-5-31 10:32

我们实验室是OD600到0.6－0.8的时候加IPTG，我想弱弱的问一下，OD值是反映菌量呢，还是菌的生长状态呢，OD 0.5的时候和0.6－0.8的时候加诱导剂会有什么不同

作者: @花开花落@ 时间: 2014-5-31 10:32

研究表明，工程菌的诱导表达通常分为两个阶段，第一阶段为细菌迅速生长繁殖阶段，外源基因不表达，这时质粒拷贝数下降，但质粒稳定性明显增加；第二阶段外源基因表达，使质粒拷贝数增加，提高外源基因表达量。根据这一特性选择合适的时间进行诱导显得非常重要，过早诱导则细菌太少，外源蛋白产量低，诱导得太迟，细菌过老，不利于外源基因的表达，因此，因此当细菌处于对数生长期（即OD600=0.6）左右时进行诱导表达为宜，这时细菌生长状态良好，有利于外源基因表达。

作者: 小菜菜aaa 时间: 2022-8-15 10:04

我想问一下要是诱导3000bp得dna表达蛋白。是不是不太可能啊？

作者: 小菜菜aaa 时间: 2022-8-15 10:05

我想问一下要是诱导3000bp得dna表达蛋白。是不是不太可能啊？

作者: 小菜菜aaa 时间: 2022-8-15 10:06

我想问一下要是诱导3000bp得dna表达蛋白。是不是不太可能啊？

作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-8 16:34

根据你描述的情况，有几个可能的原因导致你后续的诱导过程中无法再次观察到蛋白表达。

细菌状态不佳：细菌在重复诱导过程中可能出现生长问题，导致蛋白表达受到影响。这可能是由于长时间的培养、多次的冻融循环或其他因素导致的细菌健康状态下降。这可能需要进行优化培养条件、增加培养时间或重新制备新的细菌培养物。

IPTG的影响：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）是一种诱导剂，它可以诱导蛋白表达。然而，有时候长时间的IPTG暴露可能会导致质粒不稳定，或者细菌内部的代谢环境发生变化。这可能会导致质粒丢失或其他蛋白表达相关的问题。你提到有人讨论过这个问题，所以这个因素也值得考虑。在处理IPTG时，确保它的储存和使用条件符合最佳实践。

其他因素：除了上述因素，还有其他可能的因素可能会影响蛋白表达。例如，转染效率、质粒构建的准确性、启动子的选择和效率、培养条件等。检查这些因素是否可能对蛋白表达产生影响。

为了解决问题，你可以尝试以下措施：

检查培养条件：确保培养基的配制正确，并对培养条件进行优化，包括温度、时间和培养液的摇床速度等。

检查质粒稳定性：如果你怀疑IPTG的长期影响，可以尝试使用新制备的质粒，或者将质粒提取并进行验证。

检查诱导条件：重新评估IPTG的浓度和诱导时间，确保它们与之前成功诱导的实验条件相同。

检查其他相关因素：例如，质粒构建的正确性、启动子的选择、细菌感染的效率等。确保这些因素都符合实验要求。

最后，与你的实验室同事和导师进行讨论，他们对你的实验条件和具体系统更加了解，可能能提供更具体的建议和帮助。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-8 15:41

你的情况涉及到多个实验步骤和因素，导致了一些困惑。以下是一些可能的解释和建议，希望对你有所帮助：

1. 细菌状态和培养：细菌的状态对于蛋白表达非常重要。即使在IPTG诱导之后，细菌的状态可能会受到多种因素影响，例如细菌的生长速度、培养条件等。确保在诱导后的培养条件下，细菌可以保持良好的生长状态。

2. 质粒稳定性： ITPG诱导蛋白表达时，质粒的稳定性可能受到影响。质粒可能会有不稳定、丢失或重组的情况。这可能导致细菌中的蛋白表达受到影响。在诱导之前，最好确保质粒在细菌中稳定存在。

3. IPTG浓度： IPTG浓度可能需要根据不同的实验目的和蛋白质表达系统进行优化。过高或过低的IPTG浓度都可能影响蛋白表达。

4. 蛋白裂解：在裂解过程中，细菌需要彻底破裂以释放蛋白。确保使用适当的裂解方法和缓冲液，以获得高质量的裂解液。

5. 电泳条件：在跑电泳实验时，确保使用适当的凝胶浓度、电流和时间。不同的蛋白质可能需要不同的条件才能得到清晰的条带。

6. 细菌冻存和解冻：你提到细菌在冰箱中保存了一段时间。虽然在理论上，细菌在-80°C的冰箱中可以保存相当长时间，但细菌的冻存和解冻过程也可能影响细菌的状态和蛋白表达。

7. 实验重复性：在进行实验时，确保有足够的重复实验来验证结果的可靠性。

最好的方法是综合考虑这些因素，一步一步进行实验的优化和重复，以找出问题的根本原因。如果你的细菌在之前的IPTG诱导中表达了蛋白质，然后在后续诱导中没有成功，确实可能需要仔细检查质粒的稳定性和细菌状态等因素。最终，与实验室同事、导师或其他专业人士交流，共同解决问题，将是一个明智的选择。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-18 16:19

你遇到的情况可能涉及多个因素。下面是一些可能导致诱导后蛋白表达问题的原因和解决方法：

1. 细菌状态和培养条件：细菌状态、培养条件、菌液的OD值等都会影响蛋白表达。如果细菌在IPTG诱导后表达的蛋白数量较少，可能是细菌生长状态不佳或培养条件不适合蛋白表达。检查培养条件，确保菌液在IPTG诱导后适当的时间和细菌生长状态下进行裂解。

2. 质粒稳定性：你提到过质粒可能会丢失，这是一个重要因素。有些质粒可能会在细菌培养过程中逐渐丢失，特别是在高拷贝数的情况下。这可能导致后续次诱导时表达水平下降或丧失。使用质粒稳定的细菌株、检查质粒是否稳定，或者使用适当的选择性培养基维持质粒。

3. IPTG浓度和时间： IPTG的浓度和诱导时间也会影响蛋白表达。你可以尝试调整IPTG的浓度和诱导时间，观察是否有改善。

4. 蛋白毒性：一些蛋白可能对细菌有毒性，从而影响细菌的生长和蛋白表达。确保表达的蛋白不会对细菌产生毒性影响。

5. 细胞透过性：如果蛋白是定位在细胞内膜、外膜等不易透过的部位，蛋白可能难以充分表达。你可以尝试使用辅助表达蛋白或改变表达条件来增强蛋白表达。

6. 蛋白不稳定性：有些蛋白可能在表达后容易降解，导致难以检测。在裂解液中加入蛋白稳定剂，如蛋白酶抑制剂，可能有助于保持蛋白的稳定性。

总之，解决这个问题可能需要尝试不同的实验条件，包括培养条件、IPTG浓度、诱导时间等。如果有可能，你还可以考虑进行Western blot等蛋白检测方法来验证蛋白是否表达。最好在实验过程中与实验室的同事或导师进行交流，共同找到可能的解决方案。

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