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标题: 【求助】请问SDS-PAGE胶，制胶时浓缩胶不凝固是怎么回事啊？ [打印本页]

作者: veiwu 时间: 2014-6-4 17:05 标题: 【求助】请问SDS-PAGE胶，制胶时浓缩胶不凝固是怎么回事啊？

制SDS-PAGE胶时，分离胶，夹层胶，浓缩胶的浓度分别是16.5%,10%,4%,做了多次实验，分离胶和夹层胶都能凝固，就浓缩胶经常不凝，是怎么回事啊？

作者: u234 时间: 2014-6-4 17:05

是不是引发剂加得太少的缘故？

作者: veiwu 时间: 2014-6-4 17:05

这样啊，那为什么之前的那些有凝固呢？原来以为是AP不是现配的缘故，TEMED也加够量的，它很奇怪，有时候能凝固，有时候又凝不了．

作者: JK.jon 时间: 2014-6-4 17:06

既然不凝，就肯定是试剂的问题，混合要均匀。
建议将一些试剂重新配制
同时可以将TEMED适当增加，我们曾经加到过20ul,多加些是没有大碍的

作者: veiwu 时间: 2014-6-4 17:07

哦，TEMED加多的话，那ＡＰ是不是也要加多些啊，回去再试试看了

作者: veiwu 时间: 2014-6-4 17:07

谢谢大家的意见,重配试剂试试了.

作者: windy+++ 时间: 2014-6-4 17:07

既然TMEED没问题（应该没问题才对），AP 又是新配的，那不知道您是否有如下问题：
1。保证没有漏加试剂！
2。你的AP每次用几点，保存条件如何？
3。加完试剂以后是否充分混合
实在不行，那就只能重配试剂了！

作者: rxcc33 时间: 2014-6-4 17:07

是不是温度的问题，我也遇到过同样的问题，可能这个季节温度高，胶的浓度低不太好凝，我4月分做实验时凝的还挺好，7月分做的时候就凝的不好了
试着在较低温的环境下凝胶。

作者: duoduo 时间: 2014-6-4 17:08

温度的问题不大.
我前段时间也碰到浓缩胶不凝固的问题.问题主要是出在AP,AP极易潮解,应该注意它的保存环境,在每一次从新配AP之前应该观察AP是否潮解.

作者: fsdd817 时间: 2014-6-4 17:08

我们实验室的经验是，温度在37度是容易凝，低了倒不容易了，如果试剂没有问题会不会是最简单的原因，板子么有洗干净？

作者: wmp1234 时间: 2014-6-4 17:08

我浓缩胶3％4%的都配过，药品是一块配的，分离胶很好，浓缩胶就是不凝。我也发现ap固体有潮解的现象，但是分离胶好使为啥浓缩胶就不好了呢？固体ap潮解得影响到底有多大？谢谢各位大侠

作者: pengke1983 时间: 2014-6-4 17:09

1、page胶凝结过程不同于琼脂糖胶，它是一种化学反应过程，较低的温度下凝固的慢。
2、浓缩胶由于浓度较低，所以一定要比分离胶加更多的AP和TEMED，分子克隆上的浓度就可以了。
3、有时候凝结，有时候不凝结，可能就要考虑另外一个因素了，就是溶解在page溶液中的氧气。氧气抑制PAGE 胶凝集，所以，你可以在配好溶液后，进行短暂的真空抽气，以排除溶解在溶液中的氧。

作者: 98776langtao 时间: 2014-6-4 17:09

你在制备丙烯酰胺溶液时是否既加入了丙烯酰胺也加入了双丙烯酰胺?我也出现过浓缩胶凝不了的问题,就是忘加了双丙烯酰胺

作者: 30moonriver 时间: 2014-6-4 17:09

首先，可能是温度的问题，温度对胶的凝固影响很大，37度左右比较容易凝固，温度太低比较难凝固，你可以通过TEMED的量来调节一下，就是比温度高时多加点TEMED；
另外，也可能是氧的影响，当有氧气存在的条件下很难凝固，而浓缩胶本身浓度比较小，更难凝，检查一下你的梳子两边是不是完好的，如果损坏可能会有空气进入，插梳子时要按的紧一点，防止氧气的影响；

作者: wu11998866 时间: 2014-6-4 17:10

积层胶与分离胶配置是唯一的区别在于所用的TRIS-HCL不同，检查一下两种TRIS-HCL又没有问题啊

作者: PCR 时间: 2014-6-4 17:10

浓缩胶不凝，因为浓缩胶的ACRBIS 的量明显少于分离胶，出现胶不凝的现象个人认为与 TRIS 的关系不大，可能有几种可能：
1、ACR 及BIS 有无问题，检查确认，一般不要用太久的，放置太久明显影响凝结的速度，胶凝结的原理是通过 APS及TEMED 促进前两者的聚合，如前者出现问题，当然不凝了
2、最可能出现问题的地方，现在TEMED 一般都是液体，出售，一般只要还能闻到刺鼻的味道，应该没问题；但APS 很易出问题，一般建议APS 现配现用，一般我们1周配一次，避光4度保存即可，且鉴别APS 是否失效，在配置时如加水溶解时听到此次的声音，一般APS 没有问题，如一周没用完，不要舍不得丢弃，需要重配。

作者: =菓子= 时间: 2014-6-4 17:10

我的AP都变成块状的了，Sigma的，刚才把他们用小勺弄碎，挖了点放了点水试验了一下，可以听到吱吱声，哈哈。

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