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标题: 【求助】大鼠肾组织的裂解液如何配方? [打印本页]

作者: sunnyB 时间: 2014-6-7 15:26 标题: 【求助】大鼠肾组织的裂解液如何配方?

用RIPA+蛋白酶抑制剂对肾组织进行处理无法提取蛋白,望各位战友能帮忙,可否告知新的配方?实验做到现在非常着急.万分感谢!!!

作者: nn255 时间: 2014-6-7 15:26

你可以试一试这个: 我们实验室用的还挺好.
裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM(PH8.0)
由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。

作者: qqq111 时间: 2014-6-7 15:27

这是我们实验室用的配方，这两天我正在做小鼠的肾脏组织，做大鼠也可以用的，拿出来分享一下吧：
总蛋白裂解液：
10mM Tris
150mM Nacl
5mM EDTA
10%(V/V) glycerol
1% Tritox-100
1mM PMSF
10mg/ml apotinin
1mM sodium orthovanadate
1.0mg/L Leupetin
10mg/L Pepstatin A
冰浴20分钟

作者: ero11 时间: 2014-6-7 15:27

不同意楼上由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可说法。不加蛋白酶抑制剂到时候需要的目的蛋白都降解掉了，目的条带还能出来吗？
我们实验室5ml组织裂解液加亮肽素250ul，pepsetin 50ul，DTT 10ul，PMSF 100UL,不过酶抑制剂亮肽素250ul，pepsetin 50ul加一种就可以了有时

作者: kuaizige 时间: 2014-6-7 15:28

提完直接放在－７０度冰箱冻存，用的时候拿出来解冻即可

作者: sunnyB 时间: 2014-6-7 15:28

非常感谢你的解答!!!!
还想请问这与RIPE+蛋白酶抑制剂有区别么?可否替代?

作者: junjie05 时间: 2014-6-7 15:33

你好!我做的也是大鼠肾组织,我想请问你说的RIPA+PMSF提不出蛋白是什么意思？？你用什么方法验证了没有蛋白？？因为我提蛋白的方法也是RIPA+PMSF，虽然目前我的目的蛋白还没有做出来，但我觉得应该不至于说这样的裂解液无法提取蛋白！！你现在用上面战友提供的配方试过没有?效果如何？？我也正为实验发愁呢？？大家彼此学习！！

作者: sunnyB 时间: 2014-6-7 15:34

你好！当时用RIPE+SDS+PMSF提蛋白，结果组织变成絮状物，4度离心没有提出上清液，跑胶后染色没有条带。很显然组织没有融解，可能组织中有脂肪组织，即被膜没有去除。后来取正常肾组织(去除被膜）用RIPE+PMSF就提出来了。下一步准备做，不知结果会怎样?

作者: junjie05 时间: 2014-6-7 15:34

我是直接用RIPA＋pmsf的，匀浆是用手动玻璃匀浆器匀浆倒是很彻底，上清电泳后很多条带，不过我的目的蛋白是一个胞膜蛋白，关于胞膜蛋白的提取方法我也查过很多资料，众说纷纭啊，所以我现在担心的是RIPA＋PMSF的方法能否提出胞膜蛋白！！你作的目的蛋白是什么？？方法上我们互相学习！

作者: kulee 时间: 2014-6-7 15:34

我做的目的蛋白也是膜蛋白，组织样本是大鼠肝脏的，分布在亚细胞器的膜上的，如线粒体膜、核膜、内置网膜等。我也是在找膜蛋白的提取方法，我想先抽提总蛋白的，实验还未开始做，只是预想处理组织如下步骤：1、取组织加PBS于手动玻璃匀浆器中，匀浆后，500rpm3-5min离心（4度）；2、加裂解液（pierce的）及蛋白酶抑制剂冰浴10-15min，后超声3min；3、然后在沸水中煮15min；4、蛋白定量。
我打算用这种方法试一下！不知你有何高见？

作者: junjie05 时间: 2014-6-7 15:35

真是不幸,我做的膜蛋白也是线立体,内质网的,我们都做这种说起来都觉得渺茫的东西,呵呵!!你说的方法是超声破碎吗??我对方法也不是很了解的,实在不敢有什么高见!你的方法有人做过吗??能否提出膜蛋白??你先试一下吧,有好结果大家一起分享!!

作者: kulee 时间: 2014-6-7 15:35

我还没做呢定的东西还没到，等做好了告诉你！

作者: zsxan1990 时间: 2014-6-7 15:35

肾组织特别是纤维化的大鼠肾组织用玻璃匀浆器手动特难彻底匀浆，捣了一身汗，匀浆器都捣烂了，组织还是可以看的见成块的，不知道组织匀浆的时候还有其他的方法没有？

作者: junjie05 时间: 2014-6-7 15:39

你好，你说的纤维化肾组织难以匀浆，我想具体问一下你的模型具体是什么？？纤维化的程度和严重吗？？我也是作的大鼠肾组织，阿霉素肾病模型，纤维化程度不是很严重，我觉得匀浆还是和顺利，可以打的很均匀。用小的1ml的匀浆器可能费力些，但用大的那种大概5ml的匀浆器就很好用了。

作者: zsxan1990 时间: 2014-6-7 15:40 标题: 回复 #14 junjie05 的帖子

我做的是UUO模型,21天,纤维化程度比较重,反正挺难匀浆的,我打算换种方法做,以前做WESTERN结果不理想,现在考虑和组织蛋白提取有关.

作者: sunnyB 时间: 2014-6-7 15:45

我做的也是UUO模型，遇到同样的问题，不知道你打算换何种方法提取组织蛋白？能否借鉴？希望得到你的帮助。

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