标题:
【求助】第一次跑的2D
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作者:
fox_79
时间:
2014-6-8 17:22
标题:
【求助】第一次跑的2D
有成片的条纹,不知是不是蛋白?怎么造成的?
附:缺角端为酸性端,PH3-10。
样品是放线菌的蛋白。
作者:
66+77
时间:
2014-6-8 17:22
1.第一个给我的感觉就是上样量太大了,应该减少,用紫外分光光度计,吸光度在70左右就好
2.可能你的样品前处理没有很好的将核酸类的除去,请用Dnase 1和Rnase 1除去
3.没有很好的除盐,可用TCA-丙酮沉淀加低温冻,或者买专门的除盐试剂盒,BIO-RED或安玛西亚的都可以
4.蛋白堆在一起,说明IEF不是很好,考虑一下样品的前处理,如果需要相关的文献,请站内联系
作者:
chenshuanhe
时间:
2014-6-8 17:23
谢谢答复!
1 吸光度在70,我是新手,不好意思,不太明白。当时上样量是70微克。
2 IEF的电泳参数是200v 15min,300v 30min,400v 1h。是否有需要改进的地方?
3 我的样品确实没有经过处理,如果你能提供相关的资料,真的是非常感谢!
作者:
3N4G
时间:
2014-6-8 17:24
你的IEF电泳参数是不是写错了?如果真得是你所写的那样,那一向的聚集肯定是不够的.看你的电泳结果有很多的横纹,这也表明一向的聚集不够.我用BIO-RAD的仪器,7CM的小胶条一般用以下的聚焦程序:
50-60V 12-16h
250V 30min
500V 30min
4000v 3h
4000V 20,000VHT
当然,这可能只是其中的原因之一,蛋白样品的前处理也是十分重要的.双向的蛋白样品要求十分高,要无糖,无核酸,盐浓度低等等.
以上建议希望对你有帮助.祝成功!
作者:
fox_79
时间:
2014-6-8 17:24
QUOTE:
原帖由
3N4G
于 2014-6-8 17:24 发表
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你的IEF电泳参数是不是写错了?如果真得是你所写的那样,那一向的聚集肯定是不够的.看你的电泳结果有很多的横纹,这也表明一向的聚集不够.我用BIO-RAD的仪器,7CM的小胶条一般用以下的聚焦程序:
50-60V 12-16h
250V 30mi ...
谢谢你的建议!
你使用的应该是IPG胶条吧,我用的是自制IEF凝胶,先是进行了预电泳,才参照所列的参数进行一向电泳。第一次跑的参数都是参考别人的,自己还没摸索,应该还有待改进的地方。
作者:
orangecake
时间:
2014-6-8 17:25
你可以考虑一下考染,就没有银染这么敏感,点应该不会这么堆积
作者:
ffaa
时间:
2014-6-8 17:25
1.第一个给我的感觉就是上样量太大了,应该减少,用紫外分光光度计,吸光度在70左右就好
2.可能你的样品前处理没有很好的将核酸类的除去,请用Dnase 1和Rnase 1除去
3.没有很好的除盐,可用TCA-丙酮沉淀加低温冻,或者买专门的除盐试剂盒,BIO-RED或安玛西亚的都可以
4.蛋白堆在一起,说明IEF不是很好,考虑一下样品的前处理,如果需要相关的文献,请站内联系
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你好,能否给我提供样品处理和聚焦方面的文献,非常感谢。
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