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标题: 【求助】小女子求教转膜问题 [打印本页]

作者: pou 时间: 2014-6-9 17:03 标题: 【求助】小女子求教转膜问题

刚开始做western，目的蛋白17，26kd，数次转膜不成功，刚开始用恒压：75-80v，2h，未果，后改恒流：350mA，1.5h发现在大分子位置一条带，其余未见，当时考虑是否转过。样品电泳经考马斯亮蓝染色显示有目的蛋白，改用300mA，1h转膜依然没有带，为了排除其他影响，已将转移缓冲液，电泳缓冲液重配。请大侠们指点

作者: 66小飞侠 时间: 2014-6-9 17:04

认真检查一下设备的安装或缓冲液的配制有无问题,Marker转过去了吗?

作者: pou 时间: 2014-6-9 17:04

我的是普通marker，没有转上去，这些都没问题，转膜时可见明显摆泡

作者: 33号 时间: 2014-6-9 17:05

不用太担心，不知道是不是因为你转移时间太短了的缘故。因为我的目的蛋白分子量和你的是差不多的，我做转膜的时候，用的是恒流200mA，5h。
效果很好的，转膜后把膜放在丽春红里染色很快就可以看出目的条带。
所以如果你确定设备安装和操作都没有问题的话，建议你延长时间试一试。
祝你好运！

作者: 小野花 时间: 2014-6-9 17:05

我的是普通marker，没有转上去，这些都没问题，转膜时可见明显摆泡

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普通marker也应该能转上去。转完膜后不要封闭，切下marker考染一下，看看膜上有没有带。

作者: pou 时间: 2014-6-9 17:06

能详细说说你的蛋白有多大吗，我发现群里说25kd的350mA一个小时就好，所以我就试着用300mA的跑一个小时.还有我的电压波动在38-45v左右吧,是不是也说明电压小,时间应该再延长点呢?还请各位指点.

作者: 小野花 时间: 2014-6-9 17:06

1、用的膜是PVDF，0.02um孔径的吗？如果用NC膜，0.45孔径的可能会转过。
2、试试恒压100V，70～80min,在这个条件下，我转20Kd的蛋白都没问题。

作者: avi317 时间: 2014-6-9 17:06

我用的是恒流，22kd

作者: pou 时间: 2014-6-9 17:07

1、用的膜是PVDF，0.02um孔径的吗？如果用NC膜，0.45孔径的可能会转过。
2、试试恒压100V，70～80min,在这个条件下，我转20Kd的蛋白都没问题。

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PVDF，0.45um孔径
到底恒压,恒流如何选择

作者: ffaa 时间: 2014-6-9 17:07

个人看法，可能存在的问题：
1, 楼主初作western，是否能保证铺膜时候能在层次之间不存在气泡？
2，我们100v，转45’左右，都能成功！因此，我觉得你的转膜时间可能过长，有可能转过头！
3，你的目的条带小，电泳时候电压尽量小，在溴酚蓝距胶底约1cm处停，这可以保证条带不跑出胶！

作者: pou 时间: 2014-6-9 17:07

今天把转膜后的胶染色，发现只有大于97kd的蛋白剩下，其余都没有了，包括marker的其他带。而相同的样品我昨天做过电泳发现是有条带的，所以我也不知道为什么会没有转上。难道转过了，还是什么原因跑走了，很疑惑。febright所说100v电泳45min，效果好。可是衡流300ma我的电压都不达50v，虽然时间有1h。再说一下我转膜用的是biorad的湿转。

作者: cwcwcww 时间: 2014-6-9 17:08

一般根据膜的大小确定转膜的条件，一般4乘6CM 的PVDF 膜，恒流350mA 70-80min ，恒压80-100V 90min .

作者: pou 时间: 2014-6-9 17:08

今日重做转膜，上样量为37.5ug，100v，40min，发现42kd以上的条带较清楚，但小分子量仍然没有，拟加大上样量，减少时间，请各位参考，给出意见，谢谢

作者: 12xunmei 时间: 2014-6-9 17:08

我电压100v，调到电流模式看电流还不到300，甚者有些文献用24伏1h，他们的你目蛋白小，确实要多摸索转膜的条件，查查文献吧，也许你会找到解决方法，不能光靠论坛就能解决问题的，因为我们可能不是非常明确你的蛋白以及你实验室的实际情况。呵呵

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