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标题: 【求助】磷酸化蛋白的western blot [打印本页]

作者: ii077345 时间: 2014-6-9 17:55 标题: 【求助】磷酸化蛋白的western blot

我做的western的目的蛋白是一个分子量为19KD的磷酸化蛋白,但重复了好多次,做出来的结果都只有在50KD左右一条带,在19KD附近看不到一点条带的影子.我不知道磷酸化蛋白的western有什么特别注意的地方吗还是我的抗体有问题呢?请各位大侠给我出出主意啊,小弟先谢过了!

作者: ii077345 时间: 2014-6-9 17:55

我搜了一下论坛里的关于磷酸化蛋白的提取,好象都在裂解液里加了NaF和钒酸钠,而我在提蛋白的时候只加了sigma公司的cocktail,请问这对我的磷酸化蛋白有影响吗?NaF和钒酸钠在提取磷酸化蛋白的时候是一定要加的吗?希望能有大侠帮帮我啊!

作者: yjf1026 时间: 2014-6-9 17:55

要加，它们是磷酸酶抑止剂，不加的话，你的磷酸化的蛋白就有相当部分被去磷酸化！！

作者: yjf1026 时间: 2014-6-9 17:56

是这样的：
NaF是丝氨酸和苏氨酸的酯酶抑制剂，钒酸钠是酪氨酸酯酶的抑制剂。要不要加就要看你所测的磷酸化位点是什么残基。由于去磷酸化是不需要能量的，所以，一定要加你所测位点的酯酶抑制剂！
另外，50KD左右的带，有可能是你的目的条带，因为，蛋白修饰（磷酸化，糖基化，硝基化等）后分子量会增加。究竟是不是，你要查文献确认下。
希望对你有帮助。

作者: BOSS2011 时间: 2014-6-9 17:56

呵呵,这样的问题,我们遇到的太多了,还是要对你研究的目的蛋白有充分了解,有无前体,二多聚体,以及楼上说的蛋白修饰的情况.我们天天做关于磷酸化蛋白的westen,与普通的并无特殊之处

作者: ii077345 时间: 2014-6-9 17:56

我昨天在上样前重新煮了下样品,并且在上层胶里加了8M的尿素,结果在19KD附近出来了我的目的条带,但还是比较淡,50KD左右的那条带还是有,但比开始淡了些.我不知道是不是要在我的蛋白裂解液里面也要加尿素呢?具体怎么加呢?谢谢!

作者: ii077345 时间: 2014-6-9 17:57

我用的是RIPA裂解的,可不可以在RIPA里直接加尿素呢?

作者: BOSS2011 时间: 2014-6-9 17:57

我也在stat3的磷酸化的western,也是一直都没有目的的条带.很郁闷.我用的是含SDS的细胞裂解液,加过酶抑制剂~~我看楼主用的是RIPA,是磷酸化的都要用这种裂解液吗?

作者: ii077345 时间: 2014-6-9 18:00

不一定呢,不过我裂的组织.我现在就是不知道可不可以直接在RIPA里加尿素还是要更换裂解液,因为我用RIPA提的目的蛋白估计现在是以二聚体或者三聚体的形式存在,我在上层胶里加了尿素已经可以看到淡淡的目的条带,现在想在制样的时候加尿素,是不是可以在RIPA里直接加还是要重新配那种尿素和硫脲的裂解液呢,请有知道的高手帮小弟一下.

作者: flower-201 时间: 2014-6-9 18:00

我不知道你用的是PBS还是TBS洗膜？按有关要求我改用TBS 并且高温消毒灭菌后才做出我的磷酸化抗体。可能很多细菌的存在对去磷酸化有一定的影响，要不你也试试。关于裂解液我也不太清楚。

作者: ii077345 时间: 2014-6-9 18:01

我把样品重新加上样缓冲液煮沸10分钟出来了目的条带,而且二聚体也较以前变淡,但还是挺明显的一条带,不知道还有什么办法可以使二聚体完全打开呢 ?

作者: wu11998866 时间: 2014-6-9 18:01

我也在做磷酸化的蛋白，想问下大家蛋白提取后－75度一般能保存多久啊？磷酸化的蛋白保存有什么需要特别注意的吗？前几次还能做出目的条带，现在洗完胶片后什么都没有（条件都没变），在怀疑是不是蛋白坏了，蛋白提取2周，保存在－75度冰箱。困惑中，希望得到指点，多谢了！

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