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标题: 【求助】GST融合蛋白纯化出现杂带目的带，求高手指点 [打印本页]

作者: wzqzy 时间: 2014-6-9 22:18 标题: 【求助】GST融合蛋白纯化出现杂带目的带，求高手指点

本人利用PGEX3X的载体表达GST融合蛋白，蛋白大小据推测应在80-90KD之间.表达蛋白通过谷胱甘肽柱子纯化,发现虽然在推测位置有一条带,但纯化出的大量蛋白在60KD左右.
而且对比诱导前后的表达图谱,发现诱导后出85KD部位多出一条带,60KD附近的蛋白表达也明显增加,表明60KD的这些蛋白也是诱导后表达的,且可以与柱子结合.
构建的表达质粒是测过序的,中间没有无义突变.而且我的目前蛋白诱导前后也有表达,且纯化出来的蛋白中跑胶也可以看到. 但哪个60KD左右的蛋白又是怎么回事呢,万分困惑中,求高人指点...
难道是蛋白降解了么,用的是BL21(DE3)的表达菌株

作者: yyaxw84 时间: 2014-6-9 22:19

我觉得60KD左右那条带应该是表达菌株的本底表达的，但是确实会被诱导。我也是做GST的表达，现在做的还是不好，但遇到过你这种情况，并且很明显,60KD左右的带在量上超过了我的目的蛋白（也是80-90）；并且，有一次，我意外的发现我做的另一个His的蛋白也有这条带（表达菌株相同）
所以，我觉得这个应该是该菌株本身就有的；
可能是这个蛋白本身也是诱导型表达，能被IPTG诱导。

作者: standbyme 时间: 2014-6-9 22:19

你有没有作western鉴定呢，我们在实验中常会发生诱导表达出的蛋白除了目的蛋白外，还有GST本身，可能是融合蛋白发生降解所致。
pGEX的载体说明书上写该载体在表达时有形成2聚体的可能，如果是GST本身形成的二聚体，那分子量正好在58kd，与你的杂带很接近。
我觉得应该看看你的电泳图中29kd左右的位置上（即GST本身）是否也有新生条带，另外再用western鉴定一下这些是否是gst

作者: bring 时间: 2014-6-9 22:19

我做的融合表达也出现这样的情况。插入片段编码蛋白分子量为30kD，经融合表达分子量为43kD的蛋白。但是在SDS-PAGE分析时，30kD和43KD左右诱导表达前本身就存在蛋白带，经诱导后，这两处的条带明显增粗，即发生了表达；利用6His纯化柱纯化，两处都有蛋白，43kD 位置的蛋白量明显比30kD的少。
现在正在做WB分析。

作者: wzqzy 时间: 2014-6-9 22:20

QUOTE:

原帖由 yyaxw84 于 2014-6-9 22:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我觉得60KD左右那条带应该是表达菌株的本底表达的，但是确实会被诱导。我也是做GST的表达，现在做的还是不好，但遇到过你这种情况，并且很明显,60KD左右的带在量上超过了我的目的蛋白（也是80-90）；并且，有一次，我意外的发现我做的 ...

可是为什么也可以被与GST结合的珠子纯化下来呢,那你最后怎么解决这一问题呢,不然的话下游实验没有办法做啊

作者: wzqzy 时间: 2014-6-9 22:21

我现在手头没有GST的抗体,但不太象GST蛋白的二聚体,因为表达融合蛋白的菌株GST的表达量并没有被诱导表达。且同时做了GST空载体的对照,被诱导后60KD左右蛋白表达没有明显增加。

作者: redbutterfly 时间: 2014-6-9 22:21

如果有条件可以用分子筛进一步纯化一下。我以后也要做GST融合蛋白的表达纯化，多交流！祝好运！

作者: ladyhuahua 时间: 2014-6-9 22:22

呵呵，感觉应该是HSP系列的，用hsp70解释比较合理!我做过类似实验的。

作者: 分子式 时间: 2014-6-9 22:22

你有没有作western鉴定呢，我们在实验中常会发生诱导表达出的蛋白除了目的蛋白外，还有GST本身，可能是融合蛋白发生降解所致。
pGEX的载体说明书上写该载体在表达时有形成2聚体的可能，如果是GST本身形成的二聚体，那分子量正好在58kd，与你的杂带很接近。
我觉得应该看看你的电泳图中29kd左右的位置上（即GST本身）是否也有新生条带，另外再用western鉴定一下这些是否是gst

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分析的有道理，必须做一下wb才可以确定杂蛋白是否含有gst片断，如果有的话，并非降解，而是表达终止，这种情况很麻烦，基本没法在纯化上解决。

作者: quiqui008 时间: 2014-6-9 22:23

我觉得60KD左右那条带应该是表达菌株的本底表达的，但是确实会被诱导。我也是做GST的表达，现在做的还是不好，但遇到过你这种情况，并且很明显,60KD左右的带在量上超过了我的目的蛋白（也是80-90）；并且，有一次，我意外的发现我做的另一个His的蛋白也有这条带（表达菌株相同）
所以，我觉得这个应该是该菌株本身就有的；
可能是这个蛋白本身也是诱导型表达，能被IPTG诱导。
......

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我觉得这种观点说不通,如果是自身本底表达蛋白,拥有GST就已经很不可思议了,而同时拥有GST标签和HIS 标签就更不可思议了,我想不会是这种情况

作者: wzqzy 时间: 2014-6-9 22:23

呵呵，感觉应该是HSP系列的，用hsp70解释比较合理!我做过类似实验的。

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多谢，能不能具体说一下是什么意思，是说60KD左右的蛋白是HSP70么，也会被诱导表达么

作者: yyaxw84 时间: 2014-6-9 22:24

细菌中表达外源蛋白往往不能有效折叠（由于蛋白量大），这样HSP70便结合在这些misfolded 蛋白上，所以我们往往观察到HSP70量随外源蛋白量的增加而增多。这些仅供参考，不一定对，呵呵！

作者: wzqzy 时间: 2014-6-9 22:24

好的，多谢，可是HSP70似乎不该能够被谷胱苷肽珠子纯化下来啊，不过也有可能，多谢大家

作者: birdfish 时间: 2014-6-9 22:25

不可能是二聚体吧，你都煮过了，即使是二聚剔也会分开了，可能是杂蛋白吧，楼主可以洗杂蛋白的时候多洗一些，还有在蛋白提取buffer里面加点twwen或者增加洗脱buffer里面的盐离子浓度之类在蛋白纯化上优化一下条件。个人愚见，仅供参考。

作者: wzqzy 时间: 2014-6-9 22:25

有可能，多谢。我在做次试试，考虑换个菌株试试表达效果

作者: douding66 时间: 2014-6-9 22:26

蛋白加loading buffer煮后，从理论上应该是变性的，但实际上并不是对于所有的蛋白都适用，这种情况在我们实验中并不少见，文献也有报道

作者: gogo 时间: 2014-6-9 22:26

可是为什么也可以被与GST结合的珠子纯化下来呢,那你最后怎么解决这一问题呢,不然的话下游实验没有办法做啊

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我现在还没有解决好，正卡在这阿，好久了；很郁闷。但我的26kd的地方GST断裂的带很多很多很多的，但是融合蛋白的地方很少很少，甚至wb都检测不到。现在正在做Wb,看是不是能找到断裂下来的我的目的蛋白。

作者: gogo 时间: 2014-6-9 22:26

我觉得这种观点说不通,如果是自身本底表达蛋白,拥有GST就已经很不可思议了,而同时拥有GST标签和HIS 标签就更不可思议了,我想不会是这种情况

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可是我做过两个胶的比较，确实有这种情况。

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