标题:
【求助】western blot为何连内参都没有条带
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作者:
yayya
时间:
2014-6-10 09:47
标题:
【求助】western blot为何连内参都没有条带
我做了western,我的蛋白分子量是16KD,做了一个多月,没有任何条带,就连内参也没条带,不知为什么?我已经试验过PVDF膜没有问题,跑电泳和转膜都没问题,因为我和同学用的是一张膜,在一张膜上跑的电泳,转的膜,我们做了不同的抗体,同学做出来了.另我转膜时间从2个半小时到3个半小时都试过,一抗4度过夜和37度两个小时也都试过,我真不知道是什么原因,怎么会连内参都没有条带呢?郁闷啊!恳请哪位高人能帮帮我!
作者:
yes4
时间:
2014-6-10 09:47
蛋白有问题没有啊
不同大小的蛋白跑胶和转膜都是不同的
16kd是有点小了
你的膜的孔径是多大啊,胶的浓度呢,转膜什么条件?
不过你内参(不知道你内参是什么)不出我认为主要还是蛋白和抗体的问题,你用别人的蛋白跑一下,或者用好用的抗体试一下,看看问题到底在哪里
good luck!!!!!!
作者:
zhenxin
时间:
2014-6-10 09:48
我的胶是12%,电泳后做考染有清楚的条带,蛋白应该没问题,PVDF膜的孔径是0.45,转膜是是湿转105mA,3个小时,我的内参是47kD的贝它-actin.
作者:
yes4
时间:
2014-6-10 09:48
别的应该问题不大
看来很有可能是出在转膜和抗体上面了
你转膜后用丽春红染一下,看看相应大小的蛋白是否转到膜上了
如果转膜没问题的话,就是你杂交有问题
看看你的杂交条件,尤其是抗体的稀释倍数和你抗体的效价是否合适
good luck!!!!
作者:
gogo
时间:
2014-6-10 09:48
还是想办法验证一下你的抗体吧,我们同学western做了两个月,也什么都没出,一项一项的排除,最后查明就是因为试剂公司把抗体给搞错了!
虽然试剂公司把抗体给换了,但其他方面的损失也不小呀!
作者:
gemei0115
时间:
2014-6-10 09:49
一是抗体:一抗和二抗的质量都很重要(是否匹配);二是化学发光试剂的质量,最好是进口的。
作者:
ero11
时间:
2014-6-10 09:49
你蛋白样的浓度是不是太低了,可以加大一下上样量试试。另外β-actin应该是43KD吧。
作者:
zhenxin
时间:
2014-6-10 09:51
原来是我买的发光剂和二抗不行,换了这两样就做出来了,非常感谢楼上各位!
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