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标题: 【求助】关于植物总蛋白的提取问题 [打印本页]
作者: JK.jon    时间: 2014-6-10 17:13     标题: 【求助】关于植物总蛋白的提取问题

请问一下植物材料特别是果肉材料的蛋白提取有什么特别需要注意的地方呢，以下是我提取的试剂及步骤，请各位高手指教
50mmol/LTris-HCl（PH=8）、0.2%PVP、1mM PMSF、2%巯基乙醇、50mM EDTA
操作是液氮研磨成粉，加入提取液冰浴提取30min，后离心取上清液
*问：如果至此就直接作为2D-PAGE的样品可以吗？
我后面也做过提纯，用4倍丙酮-20度沉淀蛋白2次，但每次沉淀完离心，都会分三层，由上到下是：透明溶液（丙酮）- 白色一薄层（估计是蛋白）- 最底的外观象黄油一样的液体。由于黄油状物质沉在最底部，所以很难除去，估计有可能是多糖或者果胶之类的物质（我的材料是果肉）
*问：具体是什么还请高手指教。
*问：最后用抽真空去除丙酮的时候，是不是要用低温的？（我之前做的都是常温下的抽真空，因为仪器控温组件坏了~~）
抽真空后得到的也不是一般书上说的粉末状蛋白，而是胶着在一起的一块白色不透明的小块。
*问：这个有没有问题呢？要保存蛋白的话应该先溶解了再保存还是直接保存？溶解的话用什么溶液，是同提取液的Tris体系缓冲液还是用dd水就行？我之前做发现那个白色小块很难溶，我是用dd水溶解的，这是什么原因？
望高手指教，先行谢过了！！
作者: 66+77    时间: 2014-6-10 17:13

请问PMSF起什么作用，我在提取叶片蛋白，用丙酮抽提后，用上样缓冲液泡一夜来融解蛋白，可是SDS－PAGE就是跑不出来。
还有你加的EDTA作用是不是去除PVP中的金属离子？
作者: JK.jon    时间: 2014-6-10 17:14


PMSF是一种蛋白酶抑制剂，巨毒（有资料说是致死的），就是防止蛋白降解的
你的上样缓冲液中什么组成啊？没有加蛋白酶抑制剂的话很容易引起降解的。建议你的样品溶解后测下蛋白含量吧
好运~~
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:14


我的上样缓冲液是 50mmol/LTris-HCl（PH=6.8） 5%巯基乙醇 2%SDS 10%甘油 溴酚蓝
还有你加的EDTA作用是不是去除PVP中的金属离子？
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:14

我查到的资料都没有加PMSF的，请问你是参考的什么资料？
作者: JK.jon    时间: 2014-6-10 17:15

居然反过来回答问题了，呵呵，也好，互相交流嘛
EDTA也是一种蛋白酶抑制剂，不过他们抑制的效果不一样，还有很多其他的抑制剂，EDTA是最常用的一个在蛋白提取中，至于你说的驱除PVP的金属离子这个我就没有听说过了
作者: JK.jon    时间: 2014-6-10 17:15


其实PMSF可以不加不加也好，我查的资料很多有加的，我的提取液配方是参考了8个方法然后汇集而成的，由于各有改动所以就开帖求教
PMSF的作用很多资料都有的，只是这个东西巨毒，用的时候要小心
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:15


保存蛋白 用粉末状的可以放到-20或者-80 长期保存
而溶解的可以在4度保存一周
抽真空用低温是为了避免蛋白的降解
溶解液的配方可以和裂解液一致
不过按你的配方不太好 会影响双向电泳的效果
可以直接参考公司给的配方
安玛西亚的溶解配方不含IEF BUFFER是
8M 尿素 2%(w/v)CHAPS 痕量溴酚蓝 DTT现加 每2.5ml加7mg
如果你跑的是一向的SDS-PAGE可以用上样缓冲液重溶
用来跑一向时 两种的我都做过,自己觉得直接用双向的重溶液 ,重溶效果好一些 .
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:16


请问楼上，我只跑SDS-PAGE，那么你说的双向的重溶液就是 8M 尿素 2%(w/v)CHAPS 痕量溴酚蓝 DTT现加 每2.5ml加7mg ？不加别的了？尿素是什么作用？
融解和上样是一个配方的缓冲液？
作者: 987789    时间: 2014-6-10 17:16


裂解液主要成分一般包括离液剂(如 尿素),表面活性剂(如CHAPS),还原剂(如 DTT),还有选择性的蛋白酶抑制剂等,尿素为离液剂,主要作用为改变或破坏氢键等次级键的结构,使蛋白质的肽链伸展开来,充分暴露疏水中心,降低接近疏水残基的能量,以利于蛋白的提取.
裂解液和上样时的缓冲液可以一样但是,一定要保证缓冲液的盐离子浓度不能过高,否则会影响等电聚焦的.
我们实验室的裂解液还含有Tris和硫脲(和尿素的作用差不多),但是缓冲液不含有Tris.
楼上要多看些于你课题想关的文献!好运!
作者: JK.jon    时间: 2014-6-10 17:17

能不能把你提取蛋白的配方发一个啊，如果能说说步骤就更好了
我看过一些材料的提取是用丙酮+TCA来提取，根本没有用到缓冲液体系有没有加什么EDTA啊、2-ME之类的，很迷惑啊
我做的是果肉细胞的总蛋白提取，跑双向用的仪器是国产的，IEF的胶条是用空心管的那种，一切都比较落后，我看了一些资料介绍是用进口的全套装备的，不知道自己做的和配套产品的提取方式有没有什么不同的
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:19


我参照的是一个师姐的论文，用液氮研磨后用25mM的tris－hcl（ph6.8）＋PVPP冰浴浸泡三小时，然后13000rpm冷冻离心20分钟，取上清加丙酮抽提一小时，再离心，去除丙酮后加上样缓冲液浸泡一夜来融解蛋白，上样缓冲液是完全按照分子克隆配的，然后跑SDS-PAGE，我还没跑过2－D。
可是一直跑不出条带，蛋白提的还是有问题，所以很着急。
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:19


我最后用上样缓冲液融解蛋白的时候总是有不溶物，怀疑是多醣之类的东西，不知道该怎么办。
作者: bamboo16    时间: 2014-6-10 17:20

如果你先不跑2D的，我建议你这样，第一步液氮研磨后加提取液冰浴1个小时就好，然后就离心，离心后不用丙酮抽提，然后加上样缓冲液直接跑下看能不能跑出带来
作者: ffaa    时间: 2014-6-10 17:20


"50mmol/LTris-HCl（PH=8）、0.2%PVP、1mM PMSF、2%巯基乙醇、50mM EDTA
操作是液氮研磨成粉，加入提取液冰浴提取30min，后离心取上清液"直接做2D应该是跑不出东西的，跑IEF的时候电流应该会很高。最好是将液氮研磨的干粉用－20°预冷的ACETONE（含10%TCA）至于－20°3-4h，然后再用冷acetone洗至上清为透明液体，取沉淀，让acetone挥发干，再按照分子克隆配制的2Dloading buffer在37度水浴溶解30min，取上清就能用于2D了。
如果有较多的糖的话，试着用硫酸氨沉淀蛋白。
用抽真空去除acetone在常温下就可以了。而且必须注意，在低温下，2Dloading buffer中的UREA会析出。
抽真空后一般不会得到粉状的东西，你看到的白色不透明的小块就是你要的了。
至于沉淀下来的蛋白的溶解问题要看是要做SDS-PAGE还是2D。SDS-PAGE直接用1D上样缓冲液，2D用2d的上样缓冲液。这些在分子克隆上都有配方的。”白色的小块“不一定会全部溶解，因为这里面可能还有杂质，但对电泳影响不是很大。
最后想问一下你做的是什么植物？
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:20


我先试一下，谢谢哈！我做的是棉叶！
作者: JK.jon    时间: 2014-6-10 17:21

我做的是龙眼的蛋白电泳
我用我说的配方提取出来以后直接跑SDS，是可以跑出比较清晰的条带来。
跑2D的时候一向IEF的电流也不大，而且我做了两个一样的一条（A）用于二向SDS，一条（B）用于IEF后直接染色：IEF后染色结果是可以看到有带的，不过明显跑得不好，而且集中在中间一段没有跑开又有拖带；用于二向SDS的就空板了；而我在二向SDS后同时也染色了放在上面的IEF的胶条B，发现里面已经没有蛋白了，按照和前面A的对比推断，应该是IEF后有蛋白在胶条内，不过二向SDS后胶条里蛋白没有了，但也没有跑进SDS胶中，不知道去哪里了，郁闷中~~
还有问个很弱的问题，经常听大家说分子克隆，请问书的全名叫什么，我们实验室不是做分子方面的，就我一个搞分子相关的，没有听说过这个书（小汗一下~~），或者ptei318战友能不能发下相关的2个loading buffer的配方，谢谢了
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:21


cuturl('http://www.cbz.com.cn/down/soft/459.htm')
这是分子克隆的下载地址，你可以去下一个
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:22

如果你先不跑2D的，我建议你这样，第一步液氮研磨后加提取液冰浴1个小时就好，然后就离心，离心后不用丙酮抽提，然后加上样缓冲液直接跑下看能不能跑出带来

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请问你用的上样缓冲液配方是什么，我就是一直SDS就跑不出来，你的能跑出来我就试试你的配方。Smile
作者: JK.jon    时间: 2014-6-10 17:22


我听完 ptei318 说的才突然发现原来我用来跑2D的上样缓冲液不适合啊，是用来跑SDS的，应该不能用来跑IEF
复lydia5555 ：
Tris 0.7 g
SDS 2 g
甘油 10 ml（或蔗糖20g）
2-ME 5 ml
0.1%溴酚兰 5 ml
PH 6.8，dd水定容到50ml（如果你用的量不同就按比例折算）
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:23


2-ME 是什么？
作者: JK.jon    时间: 2014-6-10 17:23



QUOTE:
原帖由 49888 于 2014-6-10 17:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

2-ME 是什么？

就是 β-巯基乙醇
作者: 49888    时间: 2014-6-10 17:23


用你的配方试过了，没有巯基乙醇我就换成DTT了，我觉得作用差不多，但还是什么也没跑出来，不知道问题到底出在哪啊，头都大了！
作者: JK.jon    时间: 2014-6-10 17:24


要不你新开一帖,把你的情况详细说明吧



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