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标题: 【求助】如何提取二维电泳后感兴趣的目的蛋白？ [打印本页]

作者: lagua123 时间: 2014-6-18 16:56 标题: 【求助】如何提取二维电泳后感兴趣的目的蛋白？

如何提取纯化出二维电泳后看出的感兴趣的目的蛋白？我需要做功能实验。
说明：我的蛋白样品量很少。
希望各位相助~！

作者: fei1226com 时间: 2014-6-18 16:58

用小枪头小心把蛋白挑出来，送去打质谱，就可以知道蛋白是什么，但是质谱有时候成功率低，而且也比较贵。

作者: ladyhuahua 时间: 2014-6-18 16:58

最重要的是我现在要把这个蛋白从我的蛋白混合体系中纯化分离出来，我需要去做功能实验。仅仅知道目的蛋白是什么是不够的。
请问有什么好的方法么？是不是只有凝胶过滤层析啊？
但是我的样品量很少~~~

作者: 3N4G 时间: 2014-6-18 16:59

在下的建议,仅供参考:
1.知道了蛋白的身份,还要做功能实验,就没有必要在跑2D了,而且样品经过一次2DE,又从胶内分离出来,肯定存在损失或修饰,再做功能实验,肯怕比较的棘手.
2.个人认为好的方法是直接从混合样本中根据目的蛋白的特性做高效液相色谱将其分离出来,再做功能实验.
3.样品少,我想没有什么好的方法,多富集你的目的蛋白了,实验过程小心谨慎!
楼主好运!

作者: 131415 时间: 2014-6-18 16:59

楼主的问题太笼统了，蛋白纯化是一个很复杂的工艺流程，取决于你的蛋白来源和目的蛋白的理化特征

作者: lagua123 时间: 2014-6-18 16:59

我的蛋白是用无血清培基收的细胞培养的上清，经过二维电泳后，发现了很多感兴趣的蛋白点，想从混合的蛋白中分离出二维电泳后所看到的感兴趣的蛋白做功能试验！其中重要的一点就是保证蛋白不变性！
由于样品量少，加上上清中蛋白成分复杂，用HPLC的方法恐怕不行，大家还有什么高招？

作者: 3648755 时间: 2014-6-18 17:01

继续进行细胞培养，直到你有足够的混合物，然后再进行分离，方法你自己根据具体情况探索。

作者: lagua123 时间: 2014-6-18 17:01

就算有足够的样品又能怎么去分离我所需要的这个目的蛋白呢？用色谱的方法分离的蛋白是不是会不纯？因为我的上清中蛋白成分很多很复杂~

作者: JK.jon 时间: 2014-6-18 17:01

结合盐析（等当点沉淀）、离子交换色谱及凝胶过滤色谱，优化条件下可以得到非常纯的蛋白。做功能实验一般不需要太纯的蛋白。

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