分析测试百科

标题: 【求助】western背景总是很深 [打印本页]

作者: #问号# 时间: 2014-6-18 17:07 标题: 【求助】western背景总是很深

我最近做western,用碱性磷酸酶标记,可是染色后背景总是很深,我用含5%脱脂奶粉的TBST,是不是我的脱脂奶粉有问题啊?不知各位都用什么牌子的脱脂奶粉,我用的是伊利高蛋白高钙脱脂奶粉.是不是高蛋白影响啊?看见有进口脱脂奶粉卖的很贵,100克要300元.而且还有杂带,我降低了二抗浓度,没有结果,而且背景依然还有.请各位帮帮忙!谢谢!

作者: plaa 时间: 2014-6-18 17:07

方法：
1.二抗浓度是最主要的，再降低二抗浓度。你说你降低了，那么再降！！不要怕降到推荐浓度下
2.延长一抗、二抗后洗膜时间，可以尝试 15min*4
3.减少曝光时间
4.封闭可用更高浓度的牛奶，15%都可以，我自己用的是光明牌的，效果很好，比公司卖的Western专用封闭液也不差哪去

作者: bamboo16 时间: 2014-6-18 17:08

主要是封闭的问题
我一般是5%脱脂乳封闭一夜!!效果不错
不知道你的实验条件是怎么样的

作者: any333 时间: 2014-6-18 17:09

降低抗体孵育时间，降低一抗／二抗浓度．同时提高封闭时间．

作者: wawa 时间: 2014-6-18 17:09

我们用的脱脂奶粉和你用的是一样牌子的！没有问题！一般背景很深应该是封闭的问题！

作者: wawa 时间: 2014-6-18 17:10

我们用的脱脂奶粉和你用的是一样牌子的！没有问题！一般背景很深应该是封闭的问题！
但是我们封闭过夜和2小时都做了都很好！

作者: xyw5 时间: 2014-6-18 17:15

封闭用光明牌的,的确不错,价格便宜,量又足,我一直用它.5%

作者: #问号# 时间: 2014-6-18 17:15

谢谢各位帮忙！我一般4度封闭过夜，可还是背景深。我再降低一下二抗的浓度看看，由于我们还没有建暗室，我用碱性磷酸酶标记，我的显色液是买的天为的BCIP和NBT，不知有没有可能是显色的问题？请教各位暗室应该怎么建？我们正准备建可是不知用什么材料和具体要求，请各位指点一下，谢谢！

作者: plaa 时间: 2014-6-18 17:16

封闭过夜!

作者: #问号# 时间: 2014-6-18 17:16

谢谢各位的帮忙，我做了几次总有两条杂代出现，我用的是santa cruz的一抗，蛋白是tubulin，不知有没有人做过，能不能是抗体的问题？还是蛋白本身由于自身的结构容易出现杂代？

作者: bring 时间: 2014-6-18 17:16

背景深主要有两个原因，一是封闭不足，我们实验室常规是5－10％脱脂奶粉室温封闭3小时或4度封闭过夜。另一个问题就是洗膜不充分，如果封闭、一抗、二抗的原因你都注意了，但是背景还是很深，就应该适当增加洗膜液中的盐浓度或洗膜次数，我们实验室洗膜液中NaCl是500mM，一抗作用完毕后洗膜20min，二抗作用完毕后洗膜35min，背景非常干净。

作者: lxh031 时间: 2014-6-18 17:17

洗得不完全吧，背景都是非特异性的结合
一抗，二抗都要用封闭液进行稀释

作者: hustwb 时间: 2014-6-18 17:17

谢谢各位的帮忙，我做了几次总有两条杂代出现，我用的是santa cruz的一抗，蛋白是tubulin，不知有没有人做过，能不能是抗体的问题？还是蛋白本身由于自身的结构容易出现杂代？

==============================================================================================================

可能跟抗体有一定关系吧？我们实验室做的是α－tubulin，从sigma买的，从来没有杂带，推荐1：5000，用到1：10000还是相当的好，条带亮且单一。

作者: #问号# 时间: 2014-6-18 17:18

谢谢各位帮忙，刚才看了个帖子，是不是与二抗标记有关，我二抗是用碱性磷酸酶标记的，我做的背景深不知与这有没有关系？而且我用变性胶跑得，应该杂交后分子量应与单体的大小相当，可是我做的蛋白大小却与二聚体的大小相似，不知是何原因？又要麻烦各位了！

作者: #问号# 时间: 2014-6-18 17:18

这是最近做的持家蛋白tubulin试验照片，比以前好一些，但还是有一些杂带，而且预染marker带（天为）总是比较宽，不知什么原因？请各位帮忙！

图片附件: 18891064.snap.jpg (2014-6-18 17:18, 34.19 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=25107

作者: #问号# 时间: 2014-6-18 17:19

一抗santa cruz，二抗santa cruz（碱性磷酸酶标记），5％脱脂奶粉封闭过夜，一抗1:250孵育1小时，TTBS洗三次，每次10分钟，二抗1:2500孵育2小时，TTBS洗三次，每次10分钟。显色（天为BCIP/NBT试剂盒）。右边第一条带预染marker，右第二条普通marker，立春红染色。预染marker跑了几次总是这样，是不是marker有问题啊！

作者: ROSE李 时间: 2014-6-18 17:19

背景的颜色和一抗的质量和二抗的浓度有关!

作者: 8princess8 时间: 2014-6-18 17:19

背景很黑，可能多是抗体问题，特异性差，我们实验室也买了santa cruz的几个抗体，都出现同样问题，和公司交涉后退货了，所以买抗体是要慎重！！！

作者: #问号# 时间: 2014-6-18 17:20

谢谢各位的指教！那怎么办？它也出带难道真是抗体的问题？还有预染marker怎么带这么粗？santa cruz的抗体很差吗？我看文献都用这个公司的，再摸摸条件不知能行吗？

作者: fei1226com 时间: 2014-6-18 17:20

可提高TBST中tween的浓度，一般为0.1％,可增至0.2％。

作者: 兔唇 时间: 2014-6-18 17:21

一抗santa cruz，二抗santa cruz（碱性磷酸酶标记），5％脱脂奶粉封闭过夜，一抗1:250孵育1小时，TTBS洗三次，每次10分钟，二抗1:2500孵育2小时，TTBS洗三次，每次10分钟。显色（天为BCIP/NBT试剂盒）。右边第一条带预染marker，右第二条普通marker，立春红染色。预染marker跑了几次总是这样，是不是marker有问题啊！

===============================================================================================================

1）一抗使用浓度太高了，如Santa的抗体还是值得信赖的，至少可以1：500稀释，建议你1：800稀释使用一下试试
2）二抗1：2500稀释没问题，时间只需1h足矣
3）封闭该用10％脱脂奶粉，时间1h足矣，我做过对照，封闭1h和过夜基本上没区别。封闭后加水将剩余的10％奶粉稀释成5％，然后加一抗、二抗孵育
4）预染Marker质量太差了，我用过天为的东西，质量确实不敢恭维，价格也没优势，推荐使用MBI的预染Marker，2×250 ul，不到300元，5ul/反应上样，算下来比国产的还便宜，关键是条带很清晰

作者: #问号# 时间: 2014-6-18 17:21

谢谢各位朋友帮忙按照您说的我再做做看，脱脂奶粉我在这所有超市跑遍了买不到光明的，不知有没有好的推荐。我这个高蛋白高钙奶粉是不是对试验有一定的影响？谢谢！

作者: PINK 时间: 2014-6-18 17:22

我感觉碱性磷酸酶标记的不好用。
另外，你在加了二抗以后一定要洗的很干净，最好过夜洗。以前我也有这种情况发生，加大洗脱时间，换了封闭液，用BSA封闭，不用脱脂奶粉。
建议：
1、换二抗，用HRP标记的二抗，然后用ECL化学发光试剂盒做，发光用X光片；
2、换封闭液，用BSA；
3、加二抗后，加大洗脱时间，最好洗过夜。

作者: tuuu2 时间: 2014-6-18 17:25

预染marker建议你不要用天为的，质量不好而且贵，
我们原来用的价格是RMB180.00，100ul
Fermentas的效果非常好，我们买的价格是800多，500ul，可能还能有一些折扣，700左右就可以拿下，是彩虹的，72kDa的是红色的，其它的是蓝色的，
平均起来比天为的便宜多了
PS：我不是公司的，正宗的研究生，决不是做广告，千万不要误会。：），我原来用天为的（现在叫Tiangen），要求换marker，换了半年，申请材料，图片都送过去了，就是不答复我，结账的时候，我们老板说不退就不给支票，代理商才退了，呵呵

作者: #问号# 时间: 2014-6-18 17:26

谢谢各位的帮忙，我们没有暗室，只能用碱性磷酸酶标记，领导说建一直没有建成。哪位朋友知道怎样建暗室？谢谢！

作者: PINK 时间: 2014-6-18 17:26

用好点的窗帘遮起来就可以了,很简单的,我们实验室就是这样做的,要不然你就晚上做也可以啊

作者: nut6694 时间: 2014-6-18 17:26

哪位朋友知道怎样建暗室
一个密闭间,最好只有一扇门那样的,一块档光布(厚实一点的)挡在门上遮住光就可以了,很简单

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)