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标题: 【求助】帮我分析分析我的奇怪结果 [打印本页]

作者: ququer787 时间: 2014-6-18 17:38 标题: 【求助】帮我分析分析我的奇怪结果

我做的western　blot，条件：12%的分离胶, 4%浓缩胶, bio-rad电泳仪, 恒压150v, 约1小时; 侵入式电转移, PVDF膜, 电压100v, 300mA, 1.5小时; 5%脱脂奶粉封闭1.5小时, 1:1000一抗4度孵育过夜, 1:1000二抗孵育1.5小时; Lumiglo发光, 曝光1分钟, 显影1分钟, 定影10分钟. 图象出来了: 我的目的带为40-50之间, 但50-60之间每个样本都有一强的条带, 不知是什么, 问了几个人, 也不清楚, 现求助丁香圆内高手, 希望尽快得到答案哦, 谢谢了.(我没有加actin的抗体, 故已排除actin的可能)

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作者: glass 时间: 2014-6-18 17:38

是不是封闭的问题，我猜的。

作者: 小糖块 时间: 2014-6-18 17:39

QUOTE:

原帖由 ququer787 于 2014-6-18 17:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的western　blot，条件：12%的分离胶, 4%浓缩胶, bio-rad电泳仪, 恒压150v, 约1小时; 侵入式电转移, PVDF膜, 电压100v, 300mA, 1.5小时; 5%脱脂奶粉封闭1.5小时, 1:1000一抗4度孵育过夜, 1:1000二抗孵育1.5小时; Lu ...

b-actin是42KD，根本不会在50-60kd处有这么浓密的条带
你的程序没问题
你做了几遍？如果每次做都有这么一条强带的话，估计是一抗的特异性问题，与另一种蛋白也能发生非特异性结合。封闭是封闭不住显色这么强的条带的。

作者: ququer787 时间: 2014-6-18 17:39 标题: 回复 #3 小糖块的帖子

谢谢您，我做了好3-4遍都有这样的问题，我也怀疑是抗体问题，但一直不能肯定，想请教一下，IgG的分子量是否在此附近？

作者: moonlight45 时间: 2014-6-18 17:40

QUOTE:

原帖由 ququer787 于 2014-6-18 17:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢您，我做了好3-4遍都有这样的问题，我也怀疑是抗体问题，但一直不能肯定，想请教一下，IgG的分子量是否在此附近？

IgG的重链大约50kD

作者: ququer787 时间: 2014-6-18 17:40 标题: 回复 #5 moonlight45 的帖子

IgG应该以单体形式存在吧，即两条重链，两条轻链，还有绞链区，如果在western中会解链吗？
请教

作者: moonlight45 时间: 2014-6-18 17:40

看你跑电泳的条件啦，还原的就会解链，重链和轻链分开；非还原的就可以看到完整IgG的条带。这些是在PAGE中可以看到，最后能否呈现在western blot的膜上，还要看你的一抗具体是抗抗原的什么部位。

作者: =pkchen= 时间: 2014-6-18 17:40

杂带很正常的
你可以把封闭时间减小到1h
但是这样的话，可能带就不清晰了

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