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标题: 【求助】关于电泳前样品的处理 [打印本页]

作者: 水母 时间: 2014-6-18 18:00 标题: 【求助】关于电泳前样品的处理

各位大虾,我跑电泳是个新手看了一些帖子,对电泳前样品的处理不是太明白,想请问:
1.为什么要煮沸,到底煮沸多久就可以了?
2.煮好后加样前为什么要离心?离心后加样时是不是还是要打匀后再加样?
还有,我几个月前做过几次电泳,只有第一次做的比较好,现在又要做几种样品,昨天跑了一回,根本没条带,晕死了,准备重配一些东西,我想请问几个月前配的tris-HCL(PH6.8)和(PH8.8)的,还能用吗?要不要重配?其他一些试剂那些最好重配一下呢?

作者: 00无名指00 时间: 2014-6-18 18:00

1.煮蛋白的作用是让蛋白充分变性，这才能使蛋白在SDS-PAGE中完全靠分子量分离，测定的分子量准确性才高,一般100度至少煮5min
2,因为有些蛋白在煮沸后会有一些杂质沉淀,那样跑电泳的话就会影响电泳效果,离心后加样前的确需要混匀一下,因为离心会使蛋白浓度变的不均,加样的量就会有变化.
几个月前配的试剂应该不能再用了,因为其中的PH可能发生变化了,BUFFER的PH很重要,会影响跑胶效果,建议你所有试剂重配,那样有利于以后分析原因.

作者: ladyhuahua 时间: 2014-6-18 18:00

,我已重配试剂,我还想问,电泳后染色一般要多长时间,我看书上说要4-5小时,然后脱色还要4-5个小时,那一天时间哪来的及啊,还要配胶什么的,是不是一般都染过夜,然后第二天再脱色啊?

作者: huifeng0516 时间: 2014-6-18 18:01

你是用考染吧？我认为刚开始做时不用那么长时间，一般脱色时间是染色时间的1.5-2倍，我一般是染1-1.5h，脱色2-3h(中间换液2次)，效果还不错。
有时候如果你的蛋白的量非常低，可能需要染色时间长一些，提高灵敏度。另外好像脱色时间长的话可以提高分辨率。但我都没有试过，不知效果如何。
个人意见，你可先染1-2小时，然后脱色随时看着，勤换液，应该问题不大。祝好运！

作者: 水母 时间: 2014-6-18 18:01

哦,明白了,我还想问为什么电泳不能跑空道啊?

作者: 大海啊故乡 时间: 2014-6-18 18:01

电泳可以跑空道啊!一般加样时需要使得左右两测加样空对称,那样跑下来的胶就会不歪,好看些,因此假如你的样品是奇数个的话,那就需要在加样空里加点LOADING BUFFER来"压一压"使得加样空两测平衡,假如你的加样空是10个的话,你的蛋白样品只有5个,那你就需要加个LOADING BUFFER来充当一个样品使得左右平衡,而剩下的4个加样空就可以不加任何东西跑空道了.

作者: 水母 时间: 2014-6-18 18:02

我今天跑了一次电泳,不知道为什么,到了分离胶后就跑得非常慢,以前一个小时就跑完了,今天跑了三四个小时还没跑下来,急死我了,什么原因啊?今天染色也来不及脱色了,我该今天晚上染到明天早上呢还是放在那到明天再染?

作者: nn255 时间: 2014-6-18 18:02

分离胶跑得慢了可能跟你的电极缓冲液有关系吧，电极缓冲液如果不是新配的而是上次用过的可能就会让你的胶跑慢。
可以今天晚上染明天脱色，我们实验室一般都是过夜染色的
放到那里明天染的话你的胶不是要干掉了吗
我也是新手，不知道解答的对不对

作者: flower-201 时间: 2014-6-18 18:02

1：关于煮沸：100度，5分钟即可；
2：染胶是这样：一般制胶的时间在1个半小时，加样电泳总的需要3-4个小时，早上8点开始干活，下午2点基本可以跑完电泳。然后将胶染上，室温、摇床过夜，第二天一早脱色，中午看结果。
3：电泳泡的时间长短与电泳液的离子浓度、电压大小和整个电路中有无气泡等增加电阻的因素有关。

作者: 水母 时间: 2014-6-18 18:03

谢谢各位,我昨天跑的时候刚开始在浓缩胶跑得还好,但跑了一会我看条带有点歪,我就关掉电源把板子拿出来看看,在此过程中内外电泳液好象有所混合,然后我再开始继续跑,就发现条带跑不动,溴芬兰停在原地不动,反正最后跑了好几个小时,以前跑的时候只要一个小时就够了,不过以前的是8%的分离胶,昨天跑的是10%的,在整个操作过程中,有哪个地方做的不对,请大家帮忙指出.

作者: flower-201 时间: 2014-6-18 18:03

如果阴极和阳极电泳液混合的不多，感觉问题不大，关键是液体用了多长时间了？我们一般2周就换。
此外，用10%的胶跑的时候你的电压加了多大？我曾经加到过180v（冷却情况下），只要胶不溶就没什么。结果也不错。（当然这个也比较奔放的说。。。。）
如果你上样的时候按照楼上的说的是比较“平衡”的，那么条带再歪就可能跟胶有关系了。

作者: flower-201 时间: 2014-6-18 18:03

tris-HCL(PH6.8)和(PH8.8)按照《精编》上的说法，室温保存最好不超过1个月。

作者: 水母 时间: 2014-6-18 18:03

我们实验室没有PH计,我都是用精密试纸调的,其实心里一直没底,可是没办法,没那个条件啊,影响大不大啊?

作者: mamamiya 时间: 2014-6-18 18:04

考马斯染半小时到45分钟就ok..脱色时间长一点.2小时左右能看到带,其间换液2,3次..

作者: mamamiya 时间: 2014-6-18 18:04

考染只要30-50min就可以了，染太深了脱色会比较困难。如果第一次染色的效果不够好的话，可以重新染色，再脱色，效果不错的。电泳的电压可以调高点，这样可以节约实验的时间，分离效果也不会有太大的变化，我们可以上午做胶，下午电泳带染色，晚上脱色，第二天就可以看结果了。

作者: 大海啊故乡 时间: 2014-6-18 18:04

考染只要30-50min就可以了，染太深了脱色会比较困难。如果第一次染色的效果不够好的话，可以重新染色，再脱色，效果不错的。电泳的电压可以调高点，这样可以节约实验的时间，分离效果也不会有太大的变化，我们可以上午做胶，下午电泳带染色，晚上脱色，第二天就可以看结果了。

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