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标题: 【求助】血清蛋白跑SDS-PAGE应该怎么处理样品 [打印本页]

作者: viviwang1987 时间: 2014-6-19 09:38 标题: 【求助】血清蛋白跑SDS-PAGE应该怎么处理样品

我要血清中的一种12K的蛋白，含量大概为10－20ng/mL，我想跑page，然后做western。但是样品跑不出来，煮沸的话样品凝集，不煮的话跑出来就是一大片。请高手提示，样品应该怎么处理好。

作者: zwsyrt 时间: 2014-6-19 09:41

煮沸的话样品凝集?我从来没有碰到过这个问题啊，虽然血清蛋白做的不多．
有一种柱子专门除去血清中的高丰度蛋白，你可以考虑过完这个柱子后再走ｐａｇｅ胶

作者: XYZQ 时间: 2014-6-19 09:41

血清跑page？稀释50或100倍先，加入loading buffer变性，这时由于浓度变稀，就不会凝集了。完了再取10ul上样就行了
不过你蛋白的丰度有点低

作者: redbutterfly 时间: 2014-6-19 09:42

这么低丰度的目标蛋白在高蛋白丰度的血清样品中确实很难做，应该做预处理纯化样品并提高目标蛋白的丰度。建议可用截留分子量为50KD的离心超滤管除去高分子量蛋白，再用截留分子量为3KD的离心超滤管除去低分子量物质（血清中存在的大量盐份可干扰电泳）并浓缩样品，最后再进行分析。

作者: viviwang1987 时间: 2014-6-19 09:42

我的血清样品是大量的，如果跑柱子的话，我感觉意义就不是很大了。
如果我把样品稀释50呗的话，那我那么低的蛋白含量还能跑出来么
还有就是我跑胶跑的不好的话，可以接着做western么

作者: huifeng0516 时间: 2014-6-19 09:43

这么低丰度的目标蛋白在高蛋白丰度的血清样品中确实很难做，应该做预处理纯化样品并提高目标蛋白的丰度。建议可用截留分子量为50KD的离心超滤管除去高分子量蛋白，再用截留分子量为3KD的离心超滤管除去低分子量物质（血清中存在的大量盐份可干扰电泳）并浓缩样品，最后再进行分析。

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目前我也在为这件事情苦恼
我也要做30左右ng/ml的蛋白。。WB和ECL号称pg级都能做出来，试试看

作者: mimili_901 时间: 2014-6-19 09:43

可以将血清蛋白样品稀释１０倍后跑电泳效果应该还可以．
另外，使用超滤管处理也是不错的方法，可以试一试，方法都不难，不需要耗费多少时间和资金的．

作者: huifeng0516 时间: 2014-6-19 09:43

超滤管360块8个。。不算贵了。。

作者: duoduo 时间: 2014-6-19 09:44

QUOTE:

原帖由 huifeng0516 于 2014-6-19 09:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

超滤管360块8个。。不算贵了。。

有哪么贵?我这里好象20多30不到每个

作者: huifeng0516 时间: 2014-6-19 09:44

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原帖由 duoduo 于 2014-6-19 09:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有哪么贵?我这里好象20多30不到每个

啊啊啊。。我这里（上海）就是这么贵啊~~~4kd的

作者: zwsyrt 时间: 2014-6-19 09:45

最好做ELISA。

作者: huifeng0516 时间: 2014-6-19 09:45

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原帖由 zwsyrt 于 2014-6-19 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最好做ELISA。

我也想啊
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=6232926&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: junhun 时间: 2014-6-19 10:11

如果是直接用血清上PAGE的话一定得稀释，否则蛋白浓度过高，一煮就会凝固，另外上样buffer可用4倍的，由于分子量较小，用12%的胶慢点跑看行不行，蛋白丰度太低了，不知能不能看到，脱色时间短一点，静止脱色。

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