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标题: 【求助】教下一步该用的柱子 [打印本页]

作者: ALALA 时间: 2014-6-19 12:34 标题: 【求助】教下一步该用的柱子

很久不发帖了，不太知道规矩。如果发帖格式不对，版主看着处理吧。呵呵呵。
我现在在分离一个蛋白，其等电点9.5,分子量13.3Kd。经过cm-52,SephadexG75后作双向电泳发现是两个点。另一个点的蛋白分子量跟目的蛋白一样（sds-page一条带），但等电点稍低一点大概是8吧。现在就是再选一种柱子继续分。我查了资料初步想选sp FF，用pH4.2的buffer。大家觉得可行吗？

作者: bamboo16 时间: 2014-6-19 12:34

你用cm都分不开两种蛋白,用sp估计效果还没有cm好吧?你是怎么分得啊?离子强度的梯度还是pH的梯度啊?不过看来好象是离子梯度了!如果cm在离子梯度分不开的情况下我觉得可以试试pH梯度.或者用别的比如疏水等!

作者: ALALA 时间: 2014-6-19 12:34

用离子梯度分的，也想过用疏水，但是据说疏水柱子容易使蛋白失活，我的蛋白就是靠活性才能检测出来的，所以不到万不得已不想用这种方法。
我之所以选sp 是因为有一篇文章就用sp把我的目的蛋白分开了。我的理解是cm是弱阳离子的离子交换填料，SP是强阳离子交换的填料，强弱离子交换填料的区别是它们的作用的pH范围，强的要广一些。既然弱的分不开，就用强的试试，这种想法你觉得有道理吗？

作者: kuaizige 时间: 2014-6-19 12:35

我的理解是cm是弱阳离子的离子交换填料，SP是强阳离子交换的填料，强弱离子交换填料的区别是它们的作用的pH范围，强的要广一些。既然弱的分不开，就用强的试试，这种想法你觉得有道理吗？
我感觉你的说法前面是正确的,但后面的没有逻辑啊.
我认为你用sp可能更分不开,结果应该还不如cm的(如果还是用离子剃度)
我比较同意10007的说法,你可以把你上面的结果在用ph剃度在分一次,结果应该会好点.可以把样品缓冲液的buffer调到8.0ph 先离心上样,然后用盐洗.或者直接用ph洗.

作者: dragonkilly 时间: 2014-6-19 12:36

选sp 是因为有一篇文章就用sp把我的目的蛋白分开了。

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如果不是你的条件没有优化好，那就可能是文章中有和你目前所不一样的情况，不一定完全能照搬。也可能文章里的情况就没有你说的那个杂蛋白也不一定。
HIC如果条件合适，一般对活性应该没有什么影响。当然也因蛋白而异，但你说的因此就害怕用HIC，那不应该是理由的。
还有可能就是不同的糖基化形式，导致pI有差异。那可以做个WB，或者测序。也许就不是杂蛋白。

作者: ALALA 时间: 2014-6-19 12:37

先谢谢大家及时的回答！！
我先把我试验具体的情况再说一遍吧，我可能在开始的时候没有说清楚。我的蛋白是先用常压的离子交换柱分的，就是那种铁架台加柱子加蠕动泵加核酸蛋白检测仪的一套东西，填料是CM-52,就是我开始所说的cm，大家是不是都以为是安玛西亚的CM柱子了，不是的。之所以先上常速的柱是因为蛋白溶液里含次生代谢物，总是堵仪器。后来用的是akta purifier的预装柱，用了superdex G 75分离后是两个点。资料里面说akta的阳离子预装柱中，CM要比sp分辨率高，但是常速的柱子和akta的预装柱之间有可比性吗？就是说我用akta的sp预装柱的分辨率也比不上常速的CM吗？我也有akta CM的预装柱，要不用那个再试试？
重点说一下哦，我不是一定要揪住sP不放非用它不可才这么问的，只是觉得既然高手纷纷出场，还是抓住机会问清楚吧，呵呵，很想把这些分离的知识搞透。可自己一个人看东西不太得要领。高手们不要见笑。

作者: ALALA 时间: 2014-6-19 12:37

呵呵，“我的理解是cm是弱阳离子的离子交换填料，SP是强阳离子交换的填料，强弱离子交换填料的区别是它们的作用的pH范围，强的要广一些。”你是说我这段理解是对哦,那么SP作用的pH范围大概是多大，cm的又是多大呢？它们之间选用的标准是什么呢，是不是可以这样理解：当蛋白性质未定的时候，SP用来粗分？CM则精细一点？
还有，“我比较同意10007的说法,你可以把你上面的结果在用ph剃度在分一次,结果应该会好点.可以把样品缓冲液的buffer调到8.0ph 先离心上样,然后用盐洗.或者直接用ph洗.” ，你的建议是先让杂蛋白到达等电点沉淀下去一部分，然后再上CM是吗？如果用pH梯度的话是不是应该把pH范围设成8到9.5？这样就可以让杂蛋白带负电穿过柱子洗下来？
问得是不是太多了？呵呵呵呵呵
文章里的方法程序就是和我用的不一样呵呵呵，他们在前面用了一个我找不到的亲和柱，没办法。我们也有疏水的柱子，因为没有往那边想也就没查那方面的资料，我想再试试离子交换的柱子，如果不行在用疏水吧。
在此谢谢大家拉

作者: utt0989 时间: 2014-6-19 12:38

对于分辨率的问题.我认为主要是填料的粒径不同而导致的.同一种填料也有分辨率的高低.我觉得选择的时候应该先选填料类型.再选分辨率不同的填料.一般先用强型的填料结合蛋白.可以用于摸条件.如果它分不开两种蛋白，就可以用弱型的。因为它与蛋白的结合能力弱。这样就可以把蛋白之间的差别放大。从而达到分离目的。还有 pH梯度也不是让蛋白沉淀下去，是把样品上到柱子之后再改变洗脱液的Ph值的。目的只是让等电点低的先洗脱出来罢了。ph范围也不要从8-9.5。应该先试一下条件。起始ph可以低一些。终pH可以高一些吧！

作者: avi317 时间: 2014-6-19 12:38

我个人认为选择强弱离子交换填料至少要考虑2个条件：
1，蛋白质的在不同ph下的稳定性。使其尽量保持活性为好。
2，在偏离蛋白质的pi时，带电的多少，也就是与填料上离子配体的结合能力的强弱。
3，两个条件得同时考虑。
ph调到8是为了预防它沉淀，当然沉淀了更好哦。
万一以上不行，你就可以试用疏水层析
我以前好象还听过等点聚焦分离啊，你不防可以看看如果量少。

作者: ALALA 时间: 2014-6-19 12:39

现在想上CM用pH梯度试试去，但还有些细节问题。

“ 还有 pH梯度也不是让蛋白沉淀下去，是把样品上到柱子之后再改变洗脱液的Ph值的。目的只是让等电点低的先洗脱出来罢了。” 我不是说用pH梯度把蛋白沉淀下去哦，我只是觉得楼上让我把buffer调到8.0，那不是杂蛋白的等电点吗？那样杂蛋白岂不是就容易沉淀？是不是他的意思是让杂蛋白先沉淀一下然后再上柱用离子梯度分？我的理解对吗？
“ph范围也不要从8-9.5。应该先试一下条件。起始ph可以低一些。终pH可以高一些吧！” 如果pH范围扩大比如说从7到11吧，那岂不是要经过两个蛋白的等电点？蛋白会不会在柱子上就沉淀了？？？堵柱子很可怕的。还有如果从7到11的话，中性范围的buffer一般用PBS,碱性范围的一般用TRIS-CL吧，这中间肯定要换缓冲液吧？还是不用梯度洗，直接阶段洗脱？

作者: ALALA 时间: 2014-6-19 12:39

“ph调到8是为了预防它沉淀，当然沉淀了更好哦” 。你这句话中前半句的“它”是指目的蛋白，而“沉淀了更好的”，是指杂蛋白，对吗？

作者: any333 时间: 2014-6-19 12:40

你可以选sp sepharose HP的柱子试一试，HP的分辨率高于CM－52、以及CM sepharose FF，在AKTA 盐梯度应该可以分的开

作者: yes4 时间: 2014-6-19 12:40

HP的柱子只不过粒径小些，柱效高些。
但是，Rs并不只由柱效决定！
个人认为，只要条件优化的好，很少有非用HP的柱代替FF，否则就分不开的情况。所以，胶选定后主要还是条件的优化。
不同的胶，对不同的蛋白选择性有所差异，这要摸条件才知道。pH梯度并不好做，尽量用NaCl梯度或阶段洗即可，一般只要一两个预实验，条件还是比较好摸的；如果带电性质差异不够大，就要结合别的方法，很少一步就达到要求的。

作者: ALALA 时间: 2014-6-19 12:41

我在实验室翻了翻，没有sp sepharose HP的柱子。嗬嗬嗬，做不成喽，不过无论如何谢谢你的建议。
跟实验室的师兄聊了聊，初步定了实验方案：用pH阶段洗。先用pH9.0的buffer溶解样品，上柱，同种缓冲液洗脱，预计杂蛋白将直接穿柱下来。再用pH11的buffer把目的蛋白洗下来。师兄也建议我将杂蛋白洗下来之后用高盐离子把目的蛋白洗下来，但是我后面蛋白要测功能，盐离子的影响太大，所以我还是想用pH梯度把目的蛋白洗下来。初步就是这样了。大家（尤其是大白龙版主）觉的怎么样？
还有，绝没有跟版主套近乎的意思哦，但是我也狂迷千与千寻，这部片子在我机子里迄今为止放了有三年了，常常看下来励志，看得高兴还写读书笔记。但我最喜欢喜欢千寻，对白龙没什么感觉，呵呵呵呵。

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