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标题: 【求助】为什么我15％的胶跑得这么恐怖啊？ [打印本页]

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:24 标题: 【求助】为什么我15％的胶跑得这么恐怖啊？

15%分离胶，4％浓缩胶，Tris-Glycine-SDS体系，
30ug蛋白上样量，50ul体积。
0.03A恒流，溴酚蓝跑至底部时，20kd的那道marker还在胶的中间。
箭头标注的条带就是目的条带（17KD）。
在积层胶那部分跑起来还是很正常的，可是到了分离胶就不行了。
溴酚蓝变成很宽的弥散状，下缘是平的，可是上缘弯弯曲曲，丑得不行。
为什么跑出来会这样歪歪扭扭的呢？
是因为上样量太大？可是我以前跑10％的胶，60ug上样量都不会跑成这个样子啊。
已经排除了配胶试剂和电泳液电泳设备的问题。
请大家帮忙分析分析，拜谢~

作者: ritou1985 时间: 2014-6-20 15:25

如果不是试剂问题，那只能是样品问题了。

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:26

样品一般会有什么问题呢？
是上样量过大么？
因为是显内源的蛋白，所以上了30ug
按理来说，这个上样量不算大呀
我用的是BIO-RAD的电泳仪，1.5cm，10孔的，最多可以上80ul的量，我上50ul也不算特别多啊
虽然试剂没问题，但是实验条件也许有一些不足之处
比如电压啊
是不是应该放4度电泳啊之类的
比如吧2*的loading buffer换成4*loading buffer会不会好一些呢？
比如换成5％的浓缩胶或者浓缩胶的长度弄长一些会不会对跑胶效果有影响？
我不知道跑成上面这种样子的条带一般是什么原因造成的，所以很希望有经验的战友给予指点，我也好相应的改进实验条件
有没有谁比较有跑15％胶的心得体会呀

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:26

另外，好像我显内源的蛋白都很难跑得好看
难道都是因为上样量太大的原因么？
而且内源都是兔二抗，显出来条带都很不sharp
唉

作者: nut6694 时间: 2014-6-20 15:29

胶凝得不好？还是电压的问题？

作者: summerxx 时间: 2014-6-20 15:30

是不是4度电泳不是一个很严格的因素。
从你的电泳图上看，感觉像胶凝得不是很均匀，不知道你作胶的时候感觉胶凝的状态如何
浓缩胶可以适当的长一些也会对你的电泳有所改善，另外，你是恒流电泳的，我一般是恒压，浓缩胶跑100v，大概5-7min，进入分离胶后，恒压150v，跑出来的效果感觉不错

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:30

怎么样才可以使胶凝得比较均匀呢？

作者: tuuu2 时间: 2014-6-20 15:32

把你的电泳缓冲液重配一下,不是盐离子浓度大了(也可能上下槽液重复使用次数太多导致)就是PH值不对。另外注意电泳时电压电流不要太大.

作者: zzzz 时间: 2014-6-20 15:32

我在想有没有可能是你丙烯酰胺没有过滤？

作者: 小野花 时间: 2014-6-20 15:33

我也觉得是胶凝的问题，你可以减少APS的量，适当的延长胶聚合的时间。祝你试验顺利！

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:33

是不是4度电泳不是一个很严格的因素。
从你的电泳图上看，感觉像胶凝得不是很均匀，不知道你作胶的时候感觉胶凝的状态如何
浓缩胶可以适当的长一些也会对你的电泳有所改善，另外，你是恒流电泳的，我一般是恒压，浓缩胶跑100v，大概5-7min，进入分离胶后，恒压150v，跑出来的效果感觉不错

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电泳液的温度很重要吧？
我查了《蛋白质电泳实验技术》里面，说“电泳时电流产生的热是大部分电泳方法的主要问题。即使使用冷却装置，也会仍然在凝胶中产生温度差异。这种温度差异导致相同分子在凝胶的不同部位会有不同的迁移速度，而是蛋白带产生弯曲畸变。”
我以前也是用恒压跑的，但是上层胶都要跑20min左右啊
你跑100V的时候电流多大呀？如果是两块胶一起跑的话？

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:34

把你的电泳缓冲液重配一下,不是盐离子浓度大了(也可能上下槽液重复使用次数太多导致)就是PH值不对。另外注意电泳时电压电流不要太大.

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电泳液是新配的
跟这板15%一起跑的还有一板10%的胶
10%的那一板跑得非常漂亮
说明电泳液啊电泳仪器什么应该都没什么问题...
另外，电泳液还要调pH么？

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:34

我在想有没有可能是你丙烯酰胺没有过滤？

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都有过滤的
而且同样的acry配其他低浓度的胶都很正常

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:34

我也觉得是胶凝的问题，你可以减少APS的量，适当的延长胶聚合的时间。祝你试验顺利！

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这个是什么原理呢？

作者: summerxx 时间: 2014-6-20 15:35

电泳液是新配的
跟这板15%一起跑的还有一板10%的胶
10%的那一板跑得非常漂亮
说明电泳液啊电泳仪器什么应该都没什么问题...
另外，电泳液还要调pH么？
......

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电泳液是需要调PH的，大概8.3，如果你是按照分子克隆上的配方配出来的应该大致相当，你测一下试试！

作者: linlinstar 时间: 2014-6-20 15:35

检查一下在你电泳时，这块胶的下部是不是有很多和很大的气泡。
溴芬兰弥散正常，因为你的上样量太大（体积），试着提高你的蛋白浓度，上样量一般不要超过30微升，这样的话，跑的胶非常漂亮，
还有，你的电泳电流，我一般用80伏的恒压跑，非常好。

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:36

今天又跑了一次电泳
把可能存在的问题都排除了
可是结果还是跑得乱七八糟，跟上次的一样
这次的上样量是25ug，25ul左右（减少了近一半的上样量，没有超过xinghan88说的30ul。但是还是和上一次一样，刚进入分离胶的时候溴酚兰压得很细，跑到分离胶的越1/3就开始越来越纵向弥散，我觉得这种弥散跟以前上样量太大导致的溴酚兰压不细是两个完全不同的现象）。
浓缩胶换成了5%（和4%浓缩胶一样，跑得都挺正常的，到分离胶才不行）
浓缩胶的长度也增长了
不过我的浓缩胶100V一般都要跑半个小时的，不晓得kangpingw为什么100V只要7min就行？
检查过胶，没有气泡。
好痛苦啊
救命啊
或者换成12%的胶会不会跑得好看一点呢？

作者: moonlight45 时间: 2014-6-20 15:40

总结一下大家的回答，也是我的一点点看法：
1.制胶的问题：严格按照分子克隆上的配方配制浓缩及分离胶。在各组分的液体中，我感觉很重要的是TRIS－CL的配置，不同的浓度，不同的PH值，一定要正确。胶的浓度大些，跑的条带会好看些，但电泳的时间及电转的时间都会增加。另外在聚合时间上，一般现在的温度（20度），至少在30分钟以上。
2.上样量不算大，但体积不要太大。办法是：使用浓一些的样品，上样缓冲液可以配成5x的。这样条带会好看一些。
3.电泳时间不是很大问题。因为其取决于你的电压大小，一般均采用恒压，电压越大，产热会多，因此，最好在冰盒内电泳（如果由制冰机的话，不是问题。）但我的感觉是，电压不要太大，在80-100v，跑得时间长一些，结果会好看些。我曾经染过电泳后的胶，确实是这样。
另外，电泳缓冲液很重要，按分子克隆的配方配制，配成5x的储存液，每次使用时稀释到1x的工作液，工作液最多使用2次，也就是说，第一次是新鲜配的，用完后回收，再用一次就弃掉，不要反复用，因为其中的离子浓度已经今非昔比了。注意：配制液体时一般要配成储存液，这样存放时间较长也会比较稳定，而且经用，如果配成工作液，不能长时间存放，且一次配成用不了几次又需要配了，很麻烦。
综上，
1.请按照分子克隆检视自己所配的液体是否合适；－－关键！
2.使胶聚合充分；
3.冰盒中电泳，电压、时间中庸一些，别片面追求时间短。
祝试验成功！

作者: moonlight45 时间: 2014-6-20 15:41

今天又跑了一次电泳
把可能存在的问题都排除了
可是结果还是跑得乱七八糟，跟上次的一样
这次的上样量是25ug，25ul左右（减少了近一半的上样量，没有超过xinghan88说的30ul。但是还是和上一次一样，刚进入分离胶的时候溴酚兰压得很细，跑到分离胶的越1/3就开始越来越纵向弥散，我觉得这种弥散跟以前上样量太大导致的溴酚兰压不细是两个完全不同的现象）。
浓缩胶换成了5%（和4%浓缩胶一样，跑得都挺正常的，到分离胶才不行）
浓缩胶的长度也增长了
不过我的浓缩胶100V一般都要跑半个小时的，不晓得kangpingw为什么100V只要7min就行？
检查过胶，没有气泡。
好痛苦啊
救命啊
或者换成12%的胶会不会跑得好看一点呢？
......

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我怀疑胶和玻璃板之间有缝隙。我跑了两块10％的，其中一块，出现了异常。但也只是其中几个条带出现了快速下移。
请问：分离胶的灌胶之后，你用什么压的胶，如果是水的话，换成*醇试试（记不得了，查分子克隆）。我有一次用10％的SDS压的胶（应该是0.1％的SDS），结果胶聚合的不均匀。
另外，检查一下配胶时，SDS的用量和浓度是否正确。是否充分混匀，是否用错缓冲液，过硫酸铵和TEMED是否是最后加入的。用量是否不对（有人和我说过，分子克隆的这两个试剂有可能不对，我没有验证过）。玻璃板是否洗净。和周围跑过15％的人对比一下配胶和步骤。
从结果看，是蛋白泳动的不均匀。可能是胶的问题，也可能是胶底部微小的气泡造成。
我怀疑还是胶的聚合不均匀。可能是凝胶的时间不够，也可能是过硫酸铵和TEMED用量问题，或者未充分混匀。也可能是SDS的过量。4度电泳试试。恒压试试。
哦，对了，拔掉梳子后，有没有冲洗一下上样孔？

作者: sunnyB 时间: 2014-6-20 15:41

0.03A恒流，溴酚蓝跑至底部时，20kd的那道marker还在胶的中间。
箭头标注的条带就是目的条带（17KD）。
在积层胶那部分跑起来还是很正常的，可是到了分离胶就不行了。
溴酚蓝变成很宽的弥散状，下缘是平的，可是上缘弯弯曲曲，丑得不行。
为什么跑出来会这样歪歪扭扭的呢？
是因为上样量太大？可是我以前跑10％的胶，60ug上样量都不会跑成这个样子啊。
已经排除了配胶试剂和电泳液电泳设备的问题。
请大家帮忙分析分析，拜谢~
不知道你配的30％丙烯酰氨的PH质调过了吗？你的电泳缓冲液重新配，并注意它的PH质

作者: bring 时间: 2014-6-20 15:58

个人以为：
1. 上样量不大，30ug可以，但体积不要超过加样槽的容积。
2.电泳时恒流0.03A有点高，试试20mA吧。
3.注意降温，冷却。
4.用新的过硫酸铵。
5.所有用到的溶液要过滤。最好用高纯水。

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:58

总结一下大家的回答，也是我的一点点看法：
1.制胶的问题：严格按照分子克隆上的配方配制浓缩及分离胶。在各组分的液体中，我感觉很重要的是TRIS－CL的配置，不同的浓度，不同的PH值，一定要正确。胶的浓度大些，跑的条带会好看些，但电泳的时间及电转的时间都会增加。另外在聚合时间上，一般现在的温度（20度），至少在30分钟以上。
2.上样量不算大，但体积不要太大。办法是：使用浓一些的样品，上样缓冲液可以配成5x的。这样条带会好看一些。
3.电泳时间不是很大问题。因为其取决于你的电压大小，一般均采用恒压，电压越大，产热会多，因此，最好在冰盒内电泳（如果由制冰机的话，不是问题。）但我的感觉是，电压不要太大，在80-100v，跑得时间长一些，结果会好看些。我曾经染过电泳后的胶，确实是这样。
另外，电泳缓冲液很重要，按分子克隆的配方配制，配成5x的储存液，每次使用时稀释到1x的工作液，工作液最多使用2次，也就是说，第一次是新鲜配的，用完后回收，再用一次就弃掉，不要反复用，因为其中的离子浓度已经今非昔比了。注意：配制液体时一般要配成储存液，这样存放时间较长也会比较稳定，而且经用，如果配成工作液，不能长时间存放，且一次配成用不了几次又需要配了，很麻烦。
综上，
1.请按照分子克隆检视自己所配的液体是否合适；－－关键！
2.使胶聚合充分；
3.冰盒中电泳，电压、时间中庸一些，别片面追求时间短。
祝试验成功！
......

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pH值是对的，聚合时间积层胶和分离胶都分别达到1h以上。
5×上样缓冲液的SDS不会沉淀下来么？
用4×就已经很稠很费劲了啊
电泳是放4度的
而且电泳液原先有预冷
我们也是从5×电泳液稀释用的，最多使用2次
谢谢你的耐心解答，可是你分析的原因似乎都不是问题所在 Sad

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:58

我怀疑胶和玻璃板之间有缝隙。我跑了两块10％的，其中一块，出现了异常。但也只是其中几个条带出现了快速下移。
请问：分离胶的灌胶之后，你用什么压的胶，如果是水的话，换成*醇试试（记不得了，查分子克隆）。我有一次用10％的SDS压的胶（应该是0.1％的SDS），结果胶聚合的不均匀。
另外，检查一下配胶时，SDS的用量和浓度是否正确。是否充分混匀，是否用错缓冲液，过硫酸铵和TEMED是否是最后加入的。用量是否不对（有人和我说过，分子克隆的这两个试剂有可能不对，我没有验证过）。玻璃板是否洗净。和周围跑过15％的人对比一下配胶和步骤。
从结果看，是蛋白泳动的不均匀。可能是胶的问题，也可能是胶底部微小的气泡造成。
我怀疑还是胶的聚合不均匀。可能是凝胶的时间不够，也可能是过硫酸铵和TEMED用量问题，或者未充分混匀。也可能是SDS的过量。4度电泳试试。恒压试试。
哦，对了，拔掉梳子后，有没有冲洗一下上样孔？
......

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如果板和胶之间有缝隙的话，电泳前是可以看到气泡状的东西的
跑的时候从溴酚蓝的形状也可以看得出来
以前跑10％胶的时候也有遇到这种情况
可是这两次都不是那样的
分离胶是用无水乙醇压的，我们实验室一直用这个，应该不存在什么问题吧？
倒掉乙醇后也有用双蒸水冲洗多次，然后吸干水分。
SDS的量在配制缓冲液时反复核对过，没有配错。缓冲液也没错，APS和TEMED肯定也是最后加呀，用量也是反复验证过的，因为跑的胶很难看，所以在配胶的时候特别小心
玻璃板洗得很干净，拔掉梳子后也有冲洗加样孔。
我让实验室其他跑15％胶的同学帮忙配了一板胶，结果跑得也非常难看。
而她跑她的样品跑出来却好看很多
所以我怀疑裂解细胞的buffer不同会不会导致跑胶效果的差异？

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 15:59

0.03A恒流，溴酚蓝跑至底部时，20kd的那道marker还在胶的中间。
箭头标注的条带就是目的条带（17KD）。
在积层胶那部分跑起来还是很正常的，可是到了分离胶就不行了。
溴酚蓝变成很宽的弥散状，下缘是平的，可是上缘弯弯曲曲，丑得不行。
为什么跑出来会这样歪歪扭扭的呢？
是因为上样量太大？可是我以前跑10％的胶，60ug上样量都不会跑成这个样子啊。
已经排除了配胶试剂和电泳液电泳设备的问题。
请大家帮忙分析分析，拜谢~
不知道你配的30％丙烯酰氨的PH质调过了吗？你的电泳缓冲液重新配，并注意它的PH质
......

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这两个东西没问题

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:00

个人以为：
1. 上样量不大，30ug可以，但体积不要超过加样槽的容积。
2.电泳时恒流0.03A有点高，试试20mA吧。
3.注意降温，冷却。
4.用新的过硫酸铵。
5.所有用到的溶液要过滤。最好用高纯水。
......

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上样的体积不足加样槽容积的1/2
第二次跑胶电流就是0.02A
是放4度电泳的
第二次用的是当天新配的APS
所有溶液过滤也夸张了点吧？

作者: mamamiya 时间: 2014-6-20 16:01

buffer 的ＰＨ，样品的盐的含量（，细胞裂解液的成分）是否与核酸混在了一起．，都有可能，，在样品太多的时候这些东西影响特别大，，样品少他们的影响就小一点．．我以前跑胶的时候（１２％，，１５）也出现过这样的问题

作者: zzzz 时间: 2014-6-20 16:06

这么歪歪斜斜的胶本人就跑过，后来找到原因：5*电泳缓冲液是1年前配的，用新配的就解决了你的电泳液看了没有？

作者: jujuba 时间: 2014-6-20 16:07

不知道你的问题解决了没？
你这个问题我也遇到过，
但是我找其他实验室的同学给跑的，
所以原因很复杂，
我个人认为有一下几个问题：
1、我觉得你应该摸索一下AP和TEMED的量，尽量少加。
或者试着换一下，如果加的太多了就会导致胶聚合的不均匀。
2、你可以试试晚上做胶第二天跑胶，这样估计胶肯定充分聚合了。
祝你好运！
问题解决了告诉大家一下。

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:09

这么歪歪斜斜的胶本人就跑过，后来找到原因：5*电泳缓冲液是1年前配的，用新配的就解决了你的电泳液看了没有？

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因为跑胶跑得多
所以5*电泳液一般不到一个月就会新配一次
电泳液应该没问题
因为同时跑的10%胶跑得很漂亮

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:09

buffer 的ＰＨ，样品的盐的含量（，细胞裂解液的成分）是否与核酸混在了一起．，都有可能，，在样品太多的时候这些东西影响特别大，，样品少他们的影响就小一点．．我以前跑胶的时候（１２％，，１５）也出现过这样的问题

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那你后来怎么解决的呢？

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:28

不知道你的问题解决了没？
你这个问题我也遇到过，
但是我找其他实验室的同学给跑的，
所以原因很复杂，
我个人认为有一下几个问题：
1、我觉得你应该摸索一下AP和TEMED的量，尽量少加。
或者试着换一下，如果加的太多了就会导致胶聚合的不均匀。
2、你可以试试晚上做胶第二天跑胶，这样估计胶肯定充分聚合了。
祝你好运！
问题解决了告诉大家一下。
......

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我们实验室其它人也有跑15%的胶
虽然也有溴酚兰扩散的现象
但是最后显影出来的条带不会这样歪歪扭扭的
所以我也怀疑过是我配胶的问题
于是拜托那个同学帮我配了一板
结果也跑得非常恐怖
然后我跟上面的战友说的那样，怀疑是buffer的问题
所以就收了同时接的两个板一样的细胞量用不同的buffer裂解
结果都跑得很难看
真不知道该怎么改进了
唉

作者: remenb 时间: 2014-6-20 16:32

你试着摸索一下AP和TEMED的量，
尽量少加，
看看怎么样？
跑12％以上的胶一般不好跑，
只要一个环节有问题就跑不好。
我再想不起其他的问题了，
你可以试着换一下AP和TEMED，
祝好运！！

作者: DONT 时间: 2014-6-20 16:33

不嫌麻烦的话把各个工作液的的配置,
胶中个工作液的比例(具体到多少)都一一写出.
再不嫌麻烦把整个SOP都写上来,大家一步一步的分析....
关注中。..

作者: yjf1026 时间: 2014-6-20 16:34

有一个问题大家忽略了，就是你用的LOAGING BUFFER 是你自己配的么配方是什么 LOAGING BUFFER 配制过程中如果SDS没有加热，很难溶解，如果SDS没有完全溶解， LOAGING BUFFER 就很粘稠，电泳时条带就会变形

作者: qqq111 时间: 2014-6-20 16:34

我在做SDS -PAGE的时候也遇到过这种问题.我觉得原因可能是:
1样品处理液的问题,你可以在配制样品处理液时先过滤再加甘油.
2压缩胶凝固不均匀.
3玻璃板底部有气泡.

作者: hold住 时间: 2014-6-20 16:35

如果你能确定配胶过程没有出错的话，我想应该是样品的问题了。我以前跑过20％的胶时情况跟你的差不多，胶的浓度越高似乎对盐浓度或者上样量越敏感，我的样品里有尿素，咪唑或者PEG，当有PEG时条带变性特别明显。你的目的蛋白分子量是多少的？非得用15％的吗？是否可以用12％的试试？

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:35

有一个问题大家忽略了，就是你用的LOAGING BUFFER 是你自己配的么配方是什么 LOAGING BUFFER 配制过程中如果SDS没有加热，很难溶解，如果SDS没有完全溶解， LOAGING BUFFER 就很粘稠，电泳时条带就会变形

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loading buffer是自己配制的
成分有溴酚兰，SDS等
都是loading buffer加入离心完的上清中
然后沸水中煮10min
因为是2*loading buffer
所以SDS不难溶
buffer也不粘稠

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:35

我在做SDS -PAGE的时候也遇到过这种问题.我觉得原因可能是:
1样品处理液的问题,你可以在配制样品处理液时先过滤再加甘油.
2压缩胶凝固不均匀.
3玻璃板底部有气泡.
......

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1 咋过滤？甘油在我们平时用的loading buffer里面就有啊
2 如果是这个问题的话，怎么解决？
3 这个应该没有

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:36

如果你能确定配胶过程没有出错的话，我想应该是样品的问题了。我以前跑过20％的胶时情况跟你的差不多，胶的浓度越高似乎对盐浓度或者上样量越敏感，我的样品里有尿素，咪唑或者PEG，当有PEG时条带变性特别明显。你的目的蛋白分子量是多少的？非得用15％的吗？是否可以用12％的试试？

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17KD啊
我今天也在琢磨实在不行就试12%的好了

作者: 喵咪 时间: 2014-6-20 16:36

你的marker条带呢?是不是可以试试光跑marker看看条带是否均一,这样就可以排除制胶等方面的问题?

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:37

你的marker条带呢?是不是可以试试光跑marker看看条带是否均一,这样就可以排除制胶等方面的问题?

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marker就是越跑越宽
条带不太sharp

作者: gogo 时间: 2014-6-20 16:37

marker就是越跑越宽
条带不太sharp

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恩，我的条带还可以，但MARKER也有越跑越宽的趋势，很郁闷。
应该不是配胶的问题，因为周围很多人都配过，10%,12%,15%,都有这种问题。
望高手予以援手。

作者: linlinstar 时间: 2014-6-20 16:38

不知你想没想过是丙稀酰胺的问题，
一般超过15％的胶对丙稀酰胺的要求很高，
试着新配点丙稀酰胺试试怎么样？
丙稀酰胺见光分解为丙烯酸，
时间长了影响电泳。

作者: linlinstar 时间: 2014-6-20 16:38

还有你的丙稀酰胺是那儿产的了？
买点进口的试试，
可能会有所不同。

作者: youyou99 时间: 2014-6-20 16:38

我们的样品处理液的配方:
3.55ml ddH20
1.25ml 0.5M Tris-Hcl,PH6.8
2.5ml 甘油
2ml 10%SDS
0.2ml 0.5%溴酚兰
9.5ml 总体剂
其它成分混合均匀,用普通滤纸过滤后加甘油
临用前,按9:1加入B-ME.
关于胶凝固不均匀的问题----一定要把各成分混合均匀.

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:39

恩，我的条带还可以，但MARKER也有越跑越宽的趋势，很郁闷。
应该不是配胶的问题，因为周围很多人都配过，10%,12%,15%,都有这种问题。
望高手予以援手。

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我们跑10%的不会
12%和15%会
如何解释可以搜索本版
我发了个帖子问过

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:39

不知你想没想过是丙稀酰胺的问题，
一般超过15％的胶对丙稀酰胺的要求很高，
试着新配点丙稀酰胺试试怎么样？
丙稀酰胺见光分解为丙烯酸，
时间长了影响电泳。
......

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嗯，基本可以排除acry的问题...
目前试了一下，12%的胶虽然不好看
但比15%好一些
决定以后就用12%的了
小心一些应该目的蛋白不会跑没了吧
谢谢大家这么热心的解答
丁香园真是个好地方Smile

作者: linlinstar 时间: 2014-6-20 16:40

那就跑12％的吧，
祝你好运！

作者: kuaizige 时间: 2014-6-20 16:40

试一下在样本上样前12000转/min离心五分钟，再上样，这样也许对你有帮助，我试过的，挺好，还有胶要凝透了，跑出来的带直，胶的浓度可以多试几个，有时候丙稀酰氨的浓度不是30％而是40％（仔细看说明书），这样如果安分子克隆上的胶浓度配会配出来的大于书上的说，做western blot真是个大学问呢

作者: 831226 时间: 2014-6-20 16:41

我们用20mA的稳流跑，溴酚蓝就会横向扩散，改成100v稳压的就好了，你可以试试看。

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:42

试一下在样本上样前12000转/min离心五分钟，再上样，这样也许对你有帮助，我试过的，挺好，还有胶要凝透了，跑出来的带直，胶的浓度可以多试几个，有时候丙稀酰氨的浓度不是30％而是40％（仔细看说明书），这样如果安分子克隆上的胶浓度配会配出来的大于书上的说，做western blot真是个大学问呢

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12000转离5分钟的话，会分层的吧？
上哪一部分？

作者: JK.jon 时间: 2014-6-20 16:42

我们用20mA的稳流跑，溴酚蓝就会横向扩散，改成100v稳压的就好了，你可以试试看。

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溴酚兰横向扩散是什么意思？
如果是蛋白横向连成一条线的话
我们一般是因为蛋白上样量过大
而我们实验室用恒流或者恒压跑胶似乎效果差别不太大

作者: summerxx 时间: 2014-6-20 16:42

上周刚跑了15%的胶,100V的电压跑了两个半小时,条带非常锐利.
我感觉是你的胶没有充分混匀.
重新配AP,电泳缓冲液,缓冲液的PH值很重要,我的PH调在8.3,不知你的是多少?

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